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研究目的:探明静水压引起兔椎间盘细胞退变及基质代谢的机制,揭示身痛逐瘀汤方对静水压下兔髓核细胞的凋亡及基质代谢的调控机制及作用靶点。研究方法:将10只新西兰兔处死后无菌条件下取出L4-5椎间盘髓核,分为10组,将10组髓核细胞分离培养、鉴定及传代后,加入身痛逐瘀汤方含药血清中,在医用恒温静水压压力罐中进行干预,在0.3Mpa、1Mpa、3Mpa压力下作用2h、4h、6h后,使用倒置相差显微镜（Inverted phase contrast microscope）观察髓核细胞加压前后的形态变化及生长状况;采用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察各组髓核细胞亚显微结构（超微结构）的变化及差异;使用Cell Counting Kit-8法检测各组髓核细胞的繁殖活性;使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide流式细胞术检验各组髓核细胞的凋亡状况;使用凝胶电泳迁移法（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）检验各组髓核细胞中 p-AKT 的活跃情况;Western Blot 法检验 Sox9、Collagen Ⅱ、BAD、Caspase-9、GSK-3β在髓核细胞中含量的变化。研究结果:1.噻唑蓝（MTT）比色法筛选出中药含药血清最佳的给药浓度为15%,药物干预时间为24h。2.髓核细胞第1、2、3代的生长曲线呈S型形,3～7天时呈直线增殖,此阶段细胞生长最快、活力最高。第5、6代髓核细胞的突起呈长梭形,成长缓慢,出现退化。3.细胞形态和生长状况变化:①细胞体积:髓核细胞在0.3Mpa、1Mpa、3Mpa静水压下作用后体积均缩小,3Mpa下细胞缩小程度最大,体积最小,0.3Mpa和1Mpa下细胞体积无明显变化。②突起:0.3Mpa、1Mpa、3Mpa静水压下髓核细胞突起均变短,3 Mpa下突起短缩最显著,0.3Mpa和1 Mpa下突起短缩程度基本一致,部分髓核细胞突起不显著,呈皱缩样改变。③静水压作用0.5h内髓核细胞形态学变化明显,0.5h～6h后髓核细胞的形态学无明显差异。同一压力及作用时间下含药血清组髓核细胞的形态和生长状况比单纯压力组好,其中0.3Mpa和1 Mpa下差异显著。4.细胞超微结构变化:髓核细胞在0.3MPa,1Mpa、3MPa下作用后突起均有断裂;0.3Mpa、1Mpa下主级突起完好,次级突起断裂;3 MPa下主级突起与次级突起均有断裂。静水压作用0.5h内髓核细胞形态学变化明显,0.5h～6h后髓核细胞的形态学无明显差异。同一静水压及作用时间下含药血清组髓核细胞形态和生长状况比单纯压力组较好,其中0.3Mpa和1 Mpa下差异显著。5.CCK-8法检验压力组和中药组髓核细胞的活性:当压力作用2h下0.3Mpa、1Mpa、3Mpa静水压下细胞生存率均较低。随着压力时间的增加,0.3 Mpa、1 MPa下细胞成活率逐步上涨,其中0.3 Mpa下细胞增长速度大于1 Mpa,差异具有统计学意义（P<0.05）;在3 MPa下,随着作用时间的增加,细胞生存率逐渐下降。同一压力及作用时间下含药血清组髓核细胞活性比单纯压力组高,静水压下作用时间超过4h时,0.3 MPa下髓核细胞的增殖活性显著超过3 Mpa。6.使用Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染法检验髓核细胞的凋亡状况:当压力作用2h下0.3Mpa、1Mpa、3Mpa下细胞死亡率较低。随着压力时间的增加,0.3 Mpa、1 MPa下细胞死亡率上升,其中1 Mpa下细胞死亡率显著超过0.3 Mpa,差异具有统计学意义（P<0.05）;在3 MPa下,随着作用时间的增加,细胞死亡率明显增长。同一压力及作用时间下含药血清组髓核细胞死亡率比单纯压力组低,静水压下作用时间超过4h时,3MPa下髓核细胞的死亡率显著超过0.3Mpa（P<0.05）。7.Western Blot检测相关蛋白的表达情况:中药组的Collagen Ⅱ、Sox9整体水平高于单纯压力组,而且中药组BAD、Caspase-9、GSK-3β水平整体降低,说明身痛逐瘀汤方能有效的延缓椎间盘的退变,且0.3 MPa与1Mpa静水压下无明显差异。8.Western Blot显示身痛逐瘀汤方不仅能促进髓核细胞Collagen Ⅱ、Sox9蛋白的表达,而且能够抑制细胞内BAD、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表达,而且还能够促进细胞内p-Akt蛋白的表达,而这种促进作用能够被PI3K/Akt的抑制剂LY294002所阻断。9.PI3K/AKT活性情况:观察髓核细胞在0.3Mpa、1Mpa和3Mpa压力下作用后p-AKT的表达,中药组明显高于对照组,说明身痛逐瘀汤方可能通过激活PI3K/AKT通路来延缓髓核细胞的凋亡,从而减缓椎间盘的退变。结论:1.髓核细胞PI3K/AKT通路及相关蛋白的表达与静水压强度、作用时间、药物（“压力-时间-药物”）存在正相关,静水压下作用时间延长及压力增大均可加速髓核细胞退变。2.在椎间盘细胞开始退变（4h）的前后时间内（2h-6h）,静水压是导致兔椎间盘细胞凋亡的主要因素,低静水压环境（0.3MPa,1 MPa）下,身痛逐瘀汤方延缓椎间盘退变的效果明显,而在高静水压（3 MPa）环境下髓核细胞破坏明显,身痛逐瘀汤方疗效不佳。3.身痛逐瘀汤方能有效减缓髓核细胞退变,增加细胞活性及减少细胞凋亡,其作用机制可能与PI3K/AKT通路相关,通过促进Collagen Ⅱ、SOX9表达,抑制BAD、Caspase-9、GSK-3β蛋白表达延缓椎间盘的退变。4.身痛逐瘀汤方虽然有效延缓髓核细胞退变,但尚不能逆转其退变进程。