论文部分内容阅读
鸡新城疫（Newcastle Disease ND）俗称亚洲鸡瘟，是由禽副粘病毒1型（APMV-1）引起的鸡的一种高度接触性传染病。近年来，随着非典型ND传播与流行的日渐增多，传统的诊断方法已不能完全满足临床需要。本研究应用自制单抗建立的单抗夹心ELISA试验方法，可对该病作出快速、准确诊断。本文分为两部分。第一部分是鼠抗新城疫病毒（Newcastle Disease Virus NDV）单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定，第二部分是应用自制单抗建立夹心ELISA试验方法并对其反应条件进行优化。蔗糖密度梯度超速离心法纯化NDV效果良好。接种NDV F48E9株于10～11日龄鸡胚尿囊腔，平均每枚鸡胚收获尿囊液约8mL，血凝价（HA效价）在29～212之间。尿囊液粗提后再经20～60%、梯度为20%的蔗糖密度梯度超速离心法进一步纯化，在40～60%的蔗糖梯度层有一乳白色的病毒带。透析后，测其HA效价高达215，较纯化前有明显提高。用Folin酚法测得病毒的蛋白浓度约为1mg/mL。建立了筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA试验方法并对其反应条件进行优化。当纯化的NDV抗原每孔包被47ng，酶标抗体羊抗鼠IgG-HRP的稀释度为1∶800时，阳性对照的OD492值大于1.0，而阴性对照的OD492值小于0.1。分别用鼠抗NDV抗血清和健康鼠血清作为阳性和阴性对照，对照血清的稀释度为1∶1600。用蔗糖密度梯度超速离心法纯化的NDV作为抗原，按常规方法免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠。小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按2∶1至5∶1的比例混合，经50%PEG 4 000融合后，HAT培养基选择培养10～12天进行阳性筛选。融合细胞分置6块96孔细胞培养板培养，共576孔，其中391孔有杂交瘤细胞生长，融合率为67.9%；经间接ELISA检测上清得阳性细胞孔数40，阳性率为6.9%。挑选出其中OD492值在1.0以上的孔共10孔进行有限稀释法克隆或亚克隆。最终得到3株能稳定分泌抗体并产生腹水的杂交瘤细胞3株，分别命名为1F9、1C6、4D5。按5×105细胞/0.2 mL/只的量将3株杂交瘤细胞分别注入小鼠腹腔，约15<WP=8>天后，小鼠腹部明显涨大，用注射器分次收集腹水，腹水呈黄色至淡血红色不等。平均每只小鼠可获4～5mL腹水。应用辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化，蛋白得率为28.2%～31.4%。对3株单抗的部分生物学特性进行鉴定，结果为：三株单抗均具有较高的ELISA效价（1.5×104～1×105）；1F9、4D5两株单抗同时具有较高的HI效价（29，28），而中和效价（VN）偏低（二者都小于10）；单抗1C6株具有较高的VN效价(103)，却无血凝抑制能力（HI效价为0）。配对试验的结果显示：1C6、 4D5分别作为包被单抗和酶标记单抗时，ELISA反应有较高的OD492值，系统的敏感性较其它组合要高。在此基础上建立了单抗夹心ELISA试验方法，并对其反应条件进行优化。试验结果表明：酶标板经紫外线照射处理，包被单抗1C6、酶标单抗4D5-HRP分别作800倍、1600倍稀释，包被液、封闭液、酶标抗体稀释液分别选用0.05mol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3、l%BSA和4%NCS-PBS，酶标抗体和底物分别作用30min和15min时所测得的阳性OD492值相对较高，阳性OD492值与阴性OD492值之比最大，试验效果最好。对单抗夹心ELISA反应系统的特异性、敏感性和重复性作了鉴定。结果表明：NDV阳性血清可特异性阻断酶标抗体与NDV之间的的反应；该系统最少可检出2.5ng/mL的NDV纯化蛋白；该系统检测阳性样品的变异系数（CV）小于5%。