随着葡萄糖氧化酶(GOD)研究的不断进展，它的用途越来越广，需求量也越来越大。在医药，食品，发酵，生物等领域已得到广泛的应用。目前，主要是通过发酵黑曲霉和青霉菌来制备葡萄糖氧化酶，但由于该途径的一些不足，许多研究者都已在从事借助基因工程手段实现外源基因快速超量表达的研究。其中，巴斯德毕赤酵母表达系统由于具有能严格调控外源蛋白表达，加工修饰表达产物，背景蛋白少且能将外源蛋白分泌至胞外，表达量高等优点而受到广大科研人员的青睐。本实验克隆黑曲霉基因组中的GOD基因，同时在GOD基因序列的5’端加有编码6个组氨酸的基因序列，构建真核分泌型表达载体pPIC9K-His-GOD，用BlgⅡ线性化后转化酵母GS115，以期得到能高量分泌表达GOD，且目的蛋白易于纯化的酵母工程菌株。并通过以该酵母菌株为菌种的发酵来生产大量GOD，进而分离纯化得到高纯度的产品。这对研制高品质的GOD酶制剂来说是一个新的途径。　　 本论文取得的结果主要有：　　 1．黑曲霉ZM-8葡萄糖氧化酶基因的分子克隆：以黑曲霉ZM-8的基因组DNA为模板，根据葡萄糖氧化酶基因保守区序列，同时考虑到后期表达产物的分离纯化设计合成在5’端含有编码6个组氨酸及胶原蛋白酶位点基因序列的上游引物和下游引物，用Pfu Taq进行PCR扩增得到葡萄糖氧化酶基因。利用平末端连接技术将其与克隆载体pUC19连接，得到重组质粒pUC19-His-GOD，并进行测序。测序结果表明该黑曲霉ZM-8GOD基因全长1749 bp，包括加有的编码组氨酸标签和胶原蛋白酶的核酸序列总共1779bp，总共编码593个氨基酸。　　 2．黑曲霉ZM-8葡萄糖氧化酶基因的体外构建及遗传转化：按照设计在引物上的内切酶位点，用NotⅠ酶切割重组质粒pUC19-His-GOD，将得到的GOD基因克隆至pPIC9k的多克隆位点，构建正确的酵母表达载体pPIC9K-His-GOD，根据酵母表达手册，用BlgⅡ线性化后电转化毕赤酵母GS115，将目的基因整合到毕赤酵母染色体上的同源区。利用G418筛选能稳定含有GOD基因的阳性酵母菌株GSGOD，并通过PCR法进行验证。　　 3．平端DNA片段快速连接方法的建立：在进行黑曲霉ZM-8葡萄糖氧化酶基因的克隆实验过程中，将传统平末端连接方法加以改进。本实验用平末端内切酶SmaI切割克隆载体pUC19，不经去磷酸化酶（CIAP）的处理，在SmaI存在的连接体系中直接与未经磷酸化酶(Kinase)处理的PCR扩增的平末端产物进行连接，并转化大肠杆菌DH5a。将200μl转化菌液涂布进行蓝白筛选，结果转化平板上总菌落数约为577个，其中白斑有500个，约占总数的86.8％；而不含SmaI内切酶的连接体系的产物转化平板上的菌落几乎全为蓝色菌落；跟传统的平末端连接方法相比较，该方法不仅操作简便、经济，连接效率也更高。