【摘 要】
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分生孢子是病原真菌的主要侵染单元和繁殖单位,分生孢子的产量、进入稳定产孢期的时间、孢子产品中菌丝体的比例等都成为大规模生产的限制条件。大多数真菌存在两种产孢方式:正常产孢和微循环产孢。正常产孢是由菌丝产生孢子,是丝状真菌最普遍的产孢方式。微循环产孢是指丝状真菌在生长过程中不经菌丝生长（或只有极短的菌丝生长）阶段而直接由孢子萌发产生孢子的现象。与正常产孢相比,微循环产孢的产孢量更大,孢子大小更均一,
【基金项目】
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国家自然科学基金（碳源调控绿僵菌产孢模式转换的分子机制,项目编号:31772222）
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分生孢子是病原真菌的主要侵染单元和繁殖单位,分生孢子的产量、进入稳定产孢期的时间、孢子产品中菌丝体的比例等都成为大规模生产的限制条件。大多数真菌存在两种产孢方式:正常产孢和微循环产孢。正常产孢是由菌丝产生孢子,是丝状真菌最普遍的产孢方式。微循环产孢是指丝状真菌在生长过程中不经菌丝生长（或只有极短的菌丝生长）阶段而直接由孢子萌发产生孢子的现象。与正常产孢相比,微循环产孢的产孢量更大,孢子大小更均一,在真菌孢子大规模生产和应用中更具有优势。因此,研究昆虫病原真菌的产孢调控机制对今后真菌杀虫剂的大规模生产具有重要的现实意义。本文利用基因敲除、回复突变及超表达技术,研究了转录因子Mavib-1及与其互作的蛋白激酶Ma Rim15参与调控蝗绿僵菌产孢的作用。主要结果如下:1.通过酵母中的转录激活实验发现Mavib-1 C端有较强的转录激活活性,通过融合EGFP进行亚细胞定位观察发现Mavib-1定位在细胞核。2.Mavib-1影响蝗绿僵菌孢子的大小和菌丝的延伸。与野生型菌株（WT）孢子相比,敲除菌株（ΔMavib-1）孢子的宽度比WT和回复突变（CP）更小,Mavib-1超表达菌株（OE）孢子长度和宽度均小于WT;菌丝的隔间距测定发现ΔMavib-1和OE菌株菌丝顶端第一个细胞（p<0.01）和第二个细胞（p<0.05）的长度均显著短于WT。3.Mavib-1影响蝗绿僵菌孢子的萌发、抗紫外和抗湿热能力。与WT相比,ΔMavib-1和OE菌株萌发延迟,半数萌发时间极显著升高;经UV-B或46℃湿热处理后,ΔMavib-1菌株萌发率均显著低于WT,半抑制时间极显著降低。4.Mavib-1影响蝗绿僵菌孢子的细胞壁完整性。ΔMavib-1菌株对刚果红（CR）和H2O2胁迫的抗性减弱,OE菌株对CR和荧光增白剂（CFW）的胁迫抗性减弱。扫描电镜观察WT、ΔMavib-1、CP和OE菌株的孢子表面形态发现,WT菌株孢子表面褶皱密集且按一定规律排列,ΔMavib-1菌株的孢子表面褶皱变少且分布不均,说明Mavib-1影响了蝗绿僵菌孢子表面结构。ΔMavib-1菌株孢子疏水指数显著低于WT,OE菌株孢子疏水指数显著高于WT,说明Mavib-1影响蝗绿僵菌孢子的疏水性。5.Mavib-1是一个正调控蝗绿僵菌菌落生长、负调控微循环产孢的转录因子。蝗绿僵菌转录因子Mavib-1具有营养感知相关的NDT80＿Pho G结构域,对WT、ΔMavib-1、CP和OE菌株在不同碳源、氮源培养基上生长、产孢以及产孢量的测定,发现Mavib-1基因在营养匮乏情况下影响蝗绿僵菌的菌落颜色和生长,是黑色素形成和菌落正常生长所必需的,起正向调控作用。不管营养丰富还是匮乏,Mavib-1的缺失都影响蝗绿僵菌的产孢量。Mavib-1对碳源的利用起正向调控作用,但对不同碳源利用效率的影响程度有所不同。Mavib-1还响应不同氮源的利用,包括优势氮源和非优势氮源。在不同氮源培养基上,Mavib-1正向调控菌落的生长和菌落边缘菌丝的延伸。ΔMavib-1菌株在营养丰富的1/4 SDAY培养基上提前进行微循环产孢,在无蔗糖的营养缺乏培养基SYA-S培养基上产孢略有提前（24 h时敲除菌株已经有孢子产生,WT菌株刚形成产孢结构）;OE菌株在不同碳源培养基上产孢均比WT延迟,甚至到36 h时仍未产孢。6.Mavib-1可调控蝗绿僵菌碳水化合物活性酶表达,进而影响蝗绿僵菌的碳源代谢。为了阐明Mavib-1影响蝗绿僵菌响应不同碳源、氮源的利用而影响产孢的机制,对WT、ΔMavib-1和OE菌株在SYA培养基上培养20 h的样品进行了RNA-seq。结果发现,与WT相比,ΔMavib-1菌株中共有291个差异基因（79个上调,212个下调）;OE菌株中共有486个差异基因（318个上调,168个下调）。ΔMavib-1和OE中差异基因表达趋势相反的有22个（18个在ΔMavib-1中下调且在OE中上调,4个在ΔMavib-1中上调且在OE中下调）。ΔMavib-1菌株291个DEGs中有9个属于碳水化合物活性酶,OE菌株486个DEGs中有41个属于碳水化合物活性酶。7.通过RT-q PCR和酵母单杂交筛选到Ma Rim15是受Mavib-1调控的下游靶基因;通过生物信息学分析和酵母单杂交筛库筛选到3个C2H2型转录因子（N端有两个锌指结构的DNA binding regulatory protein Amd X、C端有两个锌指结构的putative zinc finger protein opl和中间有三个锌指结构的putative zinc finger protein crol gamma）是参与调控Mavib-1的上游基因。8.与Mavib-1相同,Ma Rim15影响蝗绿僵菌的产孢,但起正调控作用,且不影响蝗绿僵菌的生长。Mavib-1通过调控Ma Rim15影响蝗绿僵菌的产孢而不通过Ma Rim15影响蝗绿僵菌的生长。
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