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目的:探讨肝纤维化进展过程中肝枯否细胞（Kupffer cell,KCs）亚群的分布变化及程序性死亡蛋白-1（Programmed cell death protein 1,PD-1）介导的PI3K-Akt信号通路对KCs亚群分化的调控;体外研究参杖颗粒对KCs分化、KCs表面PD-1表达及其对PI3K-Akt信号通路的调控,以探索参杖颗粒阻断肝纤维化基于PD-1调控KCs分化的机制。前期研究已证实该方抗肝纤维化与肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）的活化调控机制相关,本文在此基础上进一步明确其抗肝纤维化的新靶点,为其抗肝纤维化的作用机制提供新的研究依据。方法:（1）取SD大鼠40只,随机数字表法分为对照组（16只）和模型组（24只）。模型组大鼠腹腔注射40%四氯化碳（carbon tetrachloride,CCL4）/植物油1.0ml/kg,每周2次,共计8周。对照组在相应时间腹腔注射植物油。分别于1W、2W、4W及8W每组各处死4只。（1）取出肝脏分别行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色及马松（Masson）染色,分析肝脏的病理变化及纤维化进程。以M1亚群抗体CD86和M2亚群抗体CD163进行免疫组化染色鉴别M1和M2细胞,采用ELISA检测KCs中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1的含量,检测不同时期M1和M2两个亚群与纤维化进程的关系。（2）分离培养纤维化不同时期的KCs,墨汁吞噬试验分析其吞噬能力的变化;流式细胞亚群分型检测肝纤维化进展过程中M0、M1和M2所占的比例变化趋势;免疫荧光检测肝纤维化进展过程中KCs PD-1蛋白的表达变化。（2）取SD大鼠10只,随机分为对照组和模型组,每组5只。模型组大鼠腹腔注射40%CCL4/植物油1.0ml/kg,每周2次,共计8周。对照组腹腔注射等体积的植物油。第8周末处死大鼠,取出肝脏分别行HE及Masson染色,验证肝纤维化模型造模成功。（1）分离培养各组KCs,流式细胞仪法检测KCs M0、M1和M2亚群所占的比例;免疫荧光法检测比较两组PD-1蛋白的表达水平。（2）将两组大鼠KCs分别转染PD-1 Si-RNA,以Western blot法检测转染前后各组KCs PI3k、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的水平。（3）取SD大鼠和PD-1敲除（PD-1-/-）SD大鼠各28只,腹腔注射CCL4建立大鼠肝纤维化模型,模型组使用参杖颗粒灌胃。随机分为:野生肝纤维化大鼠参杖组（16只）,野生肝纤维化大鼠对照组（12只）,PD-1-/-肝纤维化大鼠参杖组（16只）,PD-1-/-肝纤维化大鼠对照组（12只）。分别于第1周首次灌胃,第2周、第4周、第8周的末次给药后2h处理大鼠。每次每组处理大鼠3只。（1）分离培养各组KCs,流式细胞仪法检测KCs M0、M1和M2亚群所占的比例。（2）测定KCs细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1的含量。（4）取健康雄性Wistar大鼠40只制备含药血清动物,健康SD大鼠和PD-1-/-SD大鼠各12只,建立肝纤维化动物模型。建模后处死分离培养KCs,各随机分为:正常对照组A组、5倍药物浓度组B组、10倍药物浓度组C组、20倍药物浓度组D组共8个组。（1）流式细胞仪检测KCs亚群。（2）荧光定量PCR检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白mRNA的变化。（3）WB检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白及磷酸化的变化。（4）ELISA检测KCs细胞因子谱结果:（1）HE及Masson染色实验说明CCL4导致了明显的肝损伤和纤维化样病理变化,墨汁染色实验说明KCs吞噬能力逐渐减弱;免疫组化及流式分型结果均显示M1型KCs在肝纤维化早期（1-2W）快速增加,显著高于M2型KCs,第4W达峰后下降;M2型KCs早期增加较慢,到后期（8W）时超过M1型KCs。ELISA显示:M1型分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα呈现先升后降的趋势,在第4W达到最高值。M2型分泌的IL-10和TGFβ1则持续升高。免疫荧光结果表明,模型组KCs PD-1蛋白表达第2W短暂下降后上升,第4W后显著高于对照组（p<0.05）。（2）HE及Masson染色说明肝纤维化造模成功。模型组M1和M2比例增加,明显高于对照组（P<0.05）。免疫荧光结果表明,模型组KCs PD-1蛋白表达显著高于对照组（p<0.05）。Western blot表明模型组PI3k低于对照组（P<0.05）,Akt和mTOR表达差异两组无统计学意义（P>0.05）,但p-Akt和p-mTOR水平显著下降（P>0.05）。对照组和模型组KCs经培养敲除PD-1基因后,PI3k均显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）,Akt和mTOR表达没有明显变化（P>0.05）,但p-Akt和p-mTOR水平显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）流式分型和细胞因子谱结果显示:模型鼠不予治疗情况下,M1及其分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα下降较快,而M2及其分泌的IL-10、TGFβ1缓慢降低;参杖颗粒治疗后M2及其分泌的IL-10、TGFβ1下降,而M1及其分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα上升。PD-1-/-大鼠M1及其分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα上升,造模完成后逐渐下降,而M2及其分泌的IL-10、TGFβ1下降较快。（4）（1）PD-1敲除后,纤维化模型大鼠KCs细胞M1亚群比例明显升高,M2亚群比例明显降低。含药血清处理的KCs细胞M1亚群比例均明显升高,其中10倍浓度组与20倍浓度组显著高于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显;M2比例则在含药血清处理后明显降低,其中10倍浓度组与20倍浓度组显著低于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。（2）PD-1敲除后,肝纤维化大鼠模型KCs的PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达水平明显升高。对各组KCs给予含药血清处理后,PD-1 mRNA表达水平被抑制;其中10倍浓度组与20倍浓度组显著低于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。对各组KCs给予含药血清处理后,PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达水平进一步提高;其中10倍浓度组和20倍浓度组与5倍浓度组具有显著性差异,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。（3）PD-1敲除后,肝纤维化大鼠模型KCs的PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K的表达水平明显升高;Akt、mTOR非磷酸化表达水平没有明显变化,但磷酸化蛋白的水平明显升高。对WT大鼠肝纤维化模型KCs给予含药血清处理后,PD-1蛋白表达水平被抑制;其中10倍浓度组与20倍浓度组显著低于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。对各组KCs给予含药血清处理后,PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K的表达水平明显升高;Akt、mTOR非磷酸化表达水平没有明显变化,但磷酸化蛋白的水平明显升高;且具有正相关的量效关系,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。（4）PD-1敲除后,肝纤维化大鼠模型KCs M1型KCs分泌的细胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNFα的表达水平明显升高;M2型KCs分泌的细胞因子IL-10、TGFβ的表达水平明显降低。对各组KCs给予含药血清处理后,M1型KCs分泌的细胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNFα的表达水平明显升高;且具有正相关的量效关系,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。与之相反,M2型KCs分泌的细胞因子IL-10、TGFβ的表达水平明显降低;且具有负相关的量效关系,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。对含药血清中IL-4和IFNγ含量的检测结果显示,二者均较对照组含量上升,但IL-4升高程度不显著;IFNγ则显著上升,其中10倍浓度组与20倍浓度组IFNγ含量显著高于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。结论:（1）在肝纤维化早期,M1型KCs比例占优势,对细胞的活化和募集发挥主导作用;而M2型KCs在M1型KCs的活化作用下持续增加,在肝纤维化后期超过M1型KCs,更直接地促进纤维化。KCs早期表达PD-1下降引起M1早期快速上升,参与了KCs亚群的分化和肝的纤维化。（2）KCs PD-1蛋白表达的升高促进KCs的分化,引起肝的纤维化,其机制与PI3K下降,Akt、mTOR磷酸化水平降低,使PI3k/Akt/mTOR信号通路受到抑制有关。抑制PD-1基因表达可以升高Akt和mTOR磷酸化水平,激活PI3k/Akt/mTOR信号通路,抑制KCs的分化,或许可以抑制肝纤维化进程。（3）模型鼠不予治疗情况下,M1由于没有CCL4刺激,下降较快;由于属于慢性炎症后期,M2缓慢降低;参杖颗粒治疗诱导M2向M1转化。PD-1-/-大鼠M1较多,造模完成后没有CCL4刺激,也会逐渐下降;不表达PD-1,导致M2转化为M1,因此下降较快。PD-1-/-大鼠叠加参杖颗粒治疗会更快诱导M2向M1转化。（4）参杖颗粒含药血清会抑制PD-1表达,激活PI3K-Akt信号通路;含药血清10倍浓度时效果最佳。