论文部分内容阅读
六堡茶是广西有名的黑茶品种，其生产过程的关键步骤之一就是“渥堆”，此期间有大量微生物繁殖，在微生物的作用下产生特殊的香味及茶的各种物质。本研究目的在于探索六堡茶中的真菌微生物及基因资源，以期将其利用到烟制品和茶叶中。研究主要内容及结果如下:
(1)菌株的筛选与鉴定:①从广西六堡茶中分离得到四株具有潜在利用价值的真菌。通过显微观察微观形态和分子鉴定结合的方法鉴定出这四株真菌所属的物种。分别命名为:Aspergillus tubingensis GYC501(简称GYC501)、Aspergillus chevalieri E2(简称E2)、Aspergillus chevalieri E3(简称E3)和Aspergillus cristatusE6（简称E6）。②对这些真菌进行生理生化鉴定，发现这些真菌可以利用不同种类的多糖并各具特色。初步确定GYC501具有产果胶酶、纤维素酶的能力;E2具有产淀粉酶、纤维素酶的能力;E3具有产淀粉酶的能力;E6尚未检测到能产生这几种大分子水解酶。
(2)菌株的生理特性:①探索了三株散囊菌属真菌在固体橘皮粉和固体烟粉培养基内的生长情况，发现三株真菌在固体烟粉培养基中培养的适应性更好。E2无法在橘皮粉培养基内生长，E3在两种培养基中生长最快。②对三株散囊菌属真菌在液体烟梗粉培养基和液体茶粉培养基内的生长情况进行了探索，发现其在以烟梗粉为营养物质的培养基内生长更良好。同样地，E3在两种培养基中生长最快。③对液体发酵液进行了薄层层析分析，发现三株真菌在烟梗粉培养基中几乎不产生可以被提取观察到的物质，而在茶粉培养基内都能产生三种在紫外光下发粉红色光的物质。④对液体发酵液的果胶酶、纤维素酶和淀粉酶活性进行了考察，发现它们的水解酶活力都很低。总体来说E6的三种酶分泌能力最高、E3次之、E2最差。⑤对液体发酵液的还原糖和总糖含量、氨基酸含量、总抗氧化能力、DPPH·降解能力和茶多酚含量进行了测定，发现:对于液体烟梗粉培养基，相比于对照，发酵后的培养基内的总糖含量显著下降，降幅在16.29～39.98％;还原糖含量升高，增幅在2.86～3.89倍之间;氨基酸含量减少;总抗氧化能力改变不明显;DPPH·降解能力显著上升;茶多酚含量上升。对于液体茶粉培养基，相比于对照，发酵后的培养基内的总糖含量显著上升，增幅在2.07～35.25％;还原糖含量升高，增幅在131.70～627.02％之间;氨基酸含量减少，降幅在0.52～32.68％;总抗氧化能力和DPPH·降解能力显著上升;茶多酚含量显著上升。
(3)相关酶基因的克隆与表达:①从GYC501中克隆到一个编码聚半乳糖醛酸酶的基因pgⅡ，repgⅡ长度为1038bp;其成功在毕赤酵母GS115中进行了高效表达。rePGⅡ蛋白总共由346个氨基酸残基组成，甲醇诱导7d酶活力达到5672.85±204.39U/mL。蛋白实际大小约为38kDa，最适反应温度为50℃，最适pH为5.0，其在锌离子浓度为10mM时酶活性是对照的2.78倍。rePGⅡ的热稳定性不是太好:若以30min内剩余酶活力70％为稳定，rePGⅡ在水溶液稀释时稳定温度为30℃，在含20％甘油的pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释时稳定温度为40℃，在pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释时稳定温度为20℃。以聚半乳糖醛酸为底物时Vmax值为1434±159.20U/mg，Km值为4.319±0.86mg/mL。②从GYC501中克隆到一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bgN，rebgN长度为1761bp，reBGN的氨基酸残基数为587个，并成功在毕赤酵母GS115中进行了表达。③从GYC501中克隆到一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bg2E，但其在毕赤酵母GS115中没有成功表达。④从GYC501中克隆到一个编码内切葡聚糖酶的基因egB，但其在毕赤酵母GS115中没有成功表达。⑤从GYC501中克隆到一个编码果胶甲酯酶的基因pmeA，在毕赤酵母GS115中有少量表达，并具有聚半乳糖醛酸酶活性。
(1)菌株的筛选与鉴定:①从广西六堡茶中分离得到四株具有潜在利用价值的真菌。通过显微观察微观形态和分子鉴定结合的方法鉴定出这四株真菌所属的物种。分别命名为:Aspergillus tubingensis GYC501(简称GYC501)、Aspergillus chevalieri E2(简称E2)、Aspergillus chevalieri E3(简称E3)和Aspergillus cristatusE6（简称E6）。②对这些真菌进行生理生化鉴定，发现这些真菌可以利用不同种类的多糖并各具特色。初步确定GYC501具有产果胶酶、纤维素酶的能力;E2具有产淀粉酶、纤维素酶的能力;E3具有产淀粉酶的能力;E6尚未检测到能产生这几种大分子水解酶。
(2)菌株的生理特性:①探索了三株散囊菌属真菌在固体橘皮粉和固体烟粉培养基内的生长情况，发现三株真菌在固体烟粉培养基中培养的适应性更好。E2无法在橘皮粉培养基内生长，E3在两种培养基中生长最快。②对三株散囊菌属真菌在液体烟梗粉培养基和液体茶粉培养基内的生长情况进行了探索，发现其在以烟梗粉为营养物质的培养基内生长更良好。同样地，E3在两种培养基中生长最快。③对液体发酵液进行了薄层层析分析，发现三株真菌在烟梗粉培养基中几乎不产生可以被提取观察到的物质，而在茶粉培养基内都能产生三种在紫外光下发粉红色光的物质。④对液体发酵液的果胶酶、纤维素酶和淀粉酶活性进行了考察，发现它们的水解酶活力都很低。总体来说E6的三种酶分泌能力最高、E3次之、E2最差。⑤对液体发酵液的还原糖和总糖含量、氨基酸含量、总抗氧化能力、DPPH·降解能力和茶多酚含量进行了测定，发现:对于液体烟梗粉培养基，相比于对照，发酵后的培养基内的总糖含量显著下降，降幅在16.29～39.98％;还原糖含量升高，增幅在2.86～3.89倍之间;氨基酸含量减少;总抗氧化能力改变不明显;DPPH·降解能力显著上升;茶多酚含量上升。对于液体茶粉培养基，相比于对照，发酵后的培养基内的总糖含量显著上升，增幅在2.07～35.25％;还原糖含量升高，增幅在131.70～627.02％之间;氨基酸含量减少，降幅在0.52～32.68％;总抗氧化能力和DPPH·降解能力显著上升;茶多酚含量显著上升。
(3)相关酶基因的克隆与表达:①从GYC501中克隆到一个编码聚半乳糖醛酸酶的基因pgⅡ，repgⅡ长度为1038bp;其成功在毕赤酵母GS115中进行了高效表达。rePGⅡ蛋白总共由346个氨基酸残基组成，甲醇诱导7d酶活力达到5672.85±204.39U/mL。蛋白实际大小约为38kDa，最适反应温度为50℃，最适pH为5.0，其在锌离子浓度为10mM时酶活性是对照的2.78倍。rePGⅡ的热稳定性不是太好:若以30min内剩余酶活力70％为稳定，rePGⅡ在水溶液稀释时稳定温度为30℃，在含20％甘油的pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释时稳定温度为40℃，在pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释时稳定温度为20℃。以聚半乳糖醛酸为底物时Vmax值为1434±159.20U/mg，Km值为4.319±0.86mg/mL。②从GYC501中克隆到一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bgN，rebgN长度为1761bp，reBGN的氨基酸残基数为587个，并成功在毕赤酵母GS115中进行了表达。③从GYC501中克隆到一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bg2E，但其在毕赤酵母GS115中没有成功表达。④从GYC501中克隆到一个编码内切葡聚糖酶的基因egB，但其在毕赤酵母GS115中没有成功表达。⑤从GYC501中克隆到一个编码果胶甲酯酶的基因pmeA，在毕赤酵母GS115中有少量表达，并具有聚半乳糖醛酸酶活性。