Luman在小鼠卵巢、输卵管、子宫中表达

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Luman是近年来发现的与内质网应激相关的转录因子,属于碱性亮氨酸拉链蛋白家族成员。研究表明,Luman蛋白在人、小鼠、果蝇上具有高度的同源性,果蝇中的Luman蛋白(BBF2/dCREB-A)在果蝇胚胎发育的过程中有重要作用。另外,在小鼠子宫、卵巢、输卵管均检测Luman蛋白的表达。目前关于Luman在生殖过程中的作用尚不清楚。本试验应用RT-qPCR、免疫组织化学和Western blot等方法检测Luman在雌性小鼠卵巢、输卵管、子宫中的时空性表达,主要检测了Luman在发情周期中不同阶段的子宫、卵巢、和输卵管中的表达以及Luman在小鼠胚胎植入期子宫中的时空性表达。进而揭示Luman对小鼠植入前胚胎发育、胚胎植入的调节作用。1.将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,诱导表达条件优化,用电洗脱的方法纯化融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株。应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。获得1株能稳定分泌抗Luman-N-端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA效价为1:1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明该株单抗能与原核表达的GST-Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N融合蛋白没有特异性结合。获得了抗Luman-N端蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端的进一步研究。2.应用实时荧光定量PCR、免疫组织化学技术研究Luman在小鼠发情周期中不同阶段的卵巢、输卵管和子宫中的时空性表达。Luman在发情周期子卵巢和输卵管中有明显的变化规律,Luman在发情前期到发情期的表达水平逐渐增加,间情期表达水平最低。本实验结果表明:Luman在雌性小鼠生殖过程中具有重要的作用,且Luman的规律性变化可能与内固醇激素的周期性变化相关。3.应用实时荧光定量PCR、免疫组织化学技术、Western Blot技术及相关的实验小鼠模型研究Luman在胚胎植入期妊娠小鼠子宫、假孕小鼠子宫、延迟着床和着床激活小鼠子宫、人工诱导蜕膜化小鼠子宫、内固醇激素处理的小鼠子宫中的表达。数据表明:Luman在胚胎附植和蜕膜化过程中有重要的作用,且Luman的表达受雌激素和活化胚胎的调控。
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