血管性痴呆(vascular dementia VD)是发病率仅次于阿尔茨海默病的老年期痴呆。随着生活水平的不断提高,人们的生活方式,饮食结构发生了巨大变化,导致脑血管病的发生率一直居高不下,因此VD的发病率也在逐年提高,流行病学调查显示,欧美国家痴呆患者中的10%-20%为VD,在我国,VD的发病率为1.1%-3.0%,年发病率为5‰-9‰。血管性痴呆因其高发病率,高致残率而严重影响老年人的身体健康和生活质量,但其治疗却缺乏有效的方法。因此,以从中医药中探索对血管性痴呆有效的治疗方法为目的,我们开展了本项研究。目的观察中药复方参麻益智方对VD模型大鼠包括血脑屏障、神经元、胶质细胞在内的神经血管单元的影响,从而探索参麻益智方治疗血管性痴呆的作用机制。方法分组、造模与给药选用清洁级Wistar大鼠70只,雄性,10周龄,体重300±40g,将大鼠随机分为7组,每组10只,分别为空白组、假手术组、模型组、多奈哌齐组、参麻益智方中药低剂量组,中药中剂量组和中药高剂量组。模型组、多奈哌齐组、中药各组以大鼠自体微血栓栓塞法造成大鼠多梗死性痴呆模型;假手术组注射0.3ml生理盐水,余同模型组。造模结束后多奈哌齐组予0.5mg/kg药物灌胃,中药低剂量组予药物3.3mg/kg灌胃,中药中剂量组予药物6.6mg/kg灌胃,中药高剂量组予药物16.5mg/kg灌胃,假手术组、模型组给予等量蒸馏水灌胃。每日灌胃一次,连续给药4周。实验一参麻益智方对VD模型大鼠行为学及海马病理形态的影响1方法给药结束后采用ZS-001型Morris水迷宫系统检测各组大鼠的学习记忆能力。实验第1-5日进行空间探索实验,上午将大鼠从规定入水点放入水中,开始记录,待大鼠爬上平台(各部位都位于平台上)为结束时间,每组依次进行,每天从不同入水点重复四次后结束。第6日上午进行定位航行实验,从南侧入水点放入大鼠,记录大鼠穿过原来放置平台位置的次数,第四象限活动时间以及第四象限活动路程。水迷宫结束后每组大鼠断头取全脑,固定、石蜡包埋、切片,行常规HE染色和尼氏染色。2结果2.1空间探索实验与空白组相比,假手术组大鼠各天的逃避潜伏期差异没有统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组大鼠各天的逃避潜伏期明显延长,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组与参麻益智方高、中剂量组大鼠各天的逃避潜伏期明显缩短,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。2.2定位航行实验与空白组相比,假手术组大鼠的穿台次数(passingplatform times,PPT)与第四象限活动时间与路程的差异没有统计学意义;与假手术组相比,模型组大鼠穿台次数明显减少,第四象限活动时间变短,第四象限活动路程减少,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组与参麻益智方中药高剂量组穿台次数显著增多,差异有统计学意义(P<0.01);与假手术相比,多奈哌齐组与中药高剂量组第四象限活动路程增加;中药组的第四象限活动时间虽然有增加的趋势,但差异没有统计学意义。2.3 HE染色100倍显微镜下观察海马CA1区可见空白组及假手术组锥体细胞排列致密、有序、层次分明,细胞形状规则,核仁清晰;模型组锥体细胞减少甚至消失,排列无序,细胞间隙增大,细胞形状不规则;多奈哌齐及参麻益智方中药高、中剂量组海马的锥体细胞较模型组细胞数量增多,排列整齐,细胞间隙减小。2.4尼氏(Nissl)染色100倍显微镜下观察海马CA1区可见空白组、假手术组Nissl小体体积大,数量多,深染;模型组Nissl小体数量明显减少、甚至消失,体积变小,染色变浅;多奈哌齐组及参麻益智方中药高、中剂量组尼氏小体的数量、体积又有不同程度的增加,颜色加深。3结论参麻益智方可改善VD模型大鼠空间学习记忆能力。参麻益智方可减轻VD模型大鼠海马组织细胞的损伤。实验二参麻益智方对VD模型大鼠海马组织NVU中血管新生的影响1方法1.1 western blot法检测VD大鼠海马组织中HIF1 α和Notch蛋白含量1.2 ELISA法检测VD模型大鼠海马组织VEFG含量1.3 RT-PCR法检测VD模型大鼠海马组织VEGF mmRNA含量1.4免疫组化法检测VD大鼠海马组织MVD2结果2.1 HIF1 α和Notch蛋白含量与空白组相比,假手术组的HIF1 α、Notch蛋白的表达改变,无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的HIF1 α、Notch的蛋白表达稍有升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组HIF1 α、Notch的蛋白表达改变无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,参麻益智方高、中剂量组均可提高HIF1α、Notch的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01)。2.2 VEFG 含量与空白组相比,假手术组的VEGF表达改变无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的VEGF的蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,多奈哌齐组VEGF的蛋白表达改变无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,参麻益智方中药高剂量组可显著提高VEGF的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01)。2.3 VEGFmRNA 含量与空白组相比,假手术组的VEGFmRNA表达改变,无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的VEGFmRNA的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,多奈哌齐组VEGFmRNA的表达改变无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,参麻益智方中药高剂量组可显著提高VEGFmRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。2.4微血管密度(MVD)200倍显微镜下观察VD大鼠海马组织CA1区,与空白组相比,假手术组的MVD改变,无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的MVD升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,多奈哌齐组MVD改变无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,参麻益智方中药高剂量组可显著提高MVD,差异有统计学意义(P<0.01)。3结论参麻益智方可以促进VD模型大鼠海马组织HIF1 α、VEGF、Notch的蛋白表达。参麻益智方对VD模型大鼠海马组织VEGFmRNA的表达具有促进作用。参麻益智方可提高VD大鼠海马组织MVD。实验三参麻益智方对VD模型大鼠海马组织NVU神经元及胶质细胞的影响1.方法1.1 western blot检测VD模型大鼠海马组织Nrf2、H0-1、caspase3蛋白表达1.2 RT-PCR检测VD模型大鼠海马组织Nrf2 mRNA、H0-1 mmRNA的表达1.3比色法检测VD模型大鼠海马组织CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性MDA的含量1.4 Elisa检测VD模型大鼠海马组织IL-1、TNF-α蛋白表达1.5免疫组化法检测VD模型大鼠海马组织iba-1、GFAP、Neun2结果2.1 Nrf2、H0-1、caspase3 蛋白与空白组相比,假手术组Nrf2、H0-1、caspase3的蛋白表达轻度升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与假手术组相比,模型组Nrf2、H0-1、caspase3的蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组H0-1蛋白表达轻度升高、caspase3的蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,参麻益智方中药中、高剂量组Nrf2、H0-1的蛋白表达升高、caspase3的蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2.2 Nrf2 mRNA、H0-1 mRNA与空白组相比,假手术组Nrf2mRNA、HO-1mRNA表达的改变无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组Nrf2mRNA、H0-1mRNA的表达改变无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,参麻益智方中药高、中剂量组Nrf2 mRNA、参麻益智方中药高剂量组HO-1 mRNA的表达改变差异有统计学意义(P<0.01)。2.3 CAT、GSH、GSH-PX、SOD 的活性、MDA 的含量与空白组相比,假手术组的CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性、MDA的含量改变,无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性减弱,MDA的含量升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组GSH、GSH-PX、SOD的活性增强,MDA的含量下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),CAT的活性改变差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,参麻益智方中、高剂量组CAT、GSH、GSH-PX、SOD的活性增强,MDA的含量下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2.4 IL-1、TNF-α 蛋白与空白组相比,假手术组IL-1、TNF-α的蛋白含量改变,差异无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组IL-1、TNF-α的蛋白含量升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,多奈哌齐组IL-1的蛋白含量改变无统计学意义(P>0.05),TNF-α含量减少,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,参麻益智方高剂量组可显著降低IL-1、TNF-α蛋白的含量,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2.5小胶质细胞,星形胶质细胞和神经元的免疫组化结果100倍显微镜下观察海马CA1区小胶质细胞,空白组、假手术组小胶质细胞胞体小,有细长的突起,数量较少,模型组小胶质细胞胞体变圆,分支减少,数量明显增多,多奈哌齐组与参麻益智方中药高、中剂量组小胶质细胞较模型组数量减少,突起较长,胞体变小。100倍显微镜下观察海马CA1区星形胶质细胞,空白组、假手术组小胶质细胞胞体较大呈圆形或椭圆形,有突起较多,数量较少,模型组星形胶质细胞胞体变大,突起变粗,数量增多。多奈哌齐组与参麻益智方中药高、中剂量组星形胶质细胞较模型组数量减少,突起变细,胞体变小。100倍显微镜下观察海马CA1区神经元细胞,空白组、假手术组细胞排列整齐,细胞间隙小,细胞形态规则,细胞数量较多;模型组和参麻益智方低剂量组细胞排列较假手术组紊乱,细胞间隙增大,细胞形态不规则,细胞数量减少;与.模型组相比,多奈哌齐组、参麻益智方高、中剂量组细胞排列整齐,细胞间隙变小,细胞形态相对规则。3结论参麻益智方可提高VD模型大鼠海马组织Nrf2、H0-1蛋白的表达,提高CAT、GSH、GSH-PX、SOD的抗氧化活性,降低IL-1、TNF-α表达,降低海马组织MDA含量,降低caspase3的蛋白表达。具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用,从而保护海马神经元和胶质细胞。参麻益智方可减少VD模型大鼠海马组织iba-1标记的小胶质细胞、GFAP标记星形胶质细胞数量,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞激活。参麻益智方可减轻VD模型大鼠海马组织神经元的损伤。实验四参麻益智方对VD模型大鼠海马组织NVU物质信息交换的影响方法Western blot法检测VD模型大鼠海马组织CX43、AQP4蛋白表达结果与空白组相比,假手术组的CX43蛋白表达稍增加(P<0.01),AQP4表达改变无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组的CX43、AQP4的蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,参麻益智方高、中剂量组可降低CX43、AQP4的蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.01)。结论参麻益智方可降低VD模型大鼠海马组织CX43、AQP4的表达。