结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,且疗效仍不乐观,近25年结直肠癌的5年生存率徘徊在50~60%左右。导入抑癌基因是肿瘤基因治疗的重要策略,筛选并发现新的抑癌基因可为肿瘤治疗提供新的切入点。细丝蛋白A(filamin A, FLNa)是非肌性肌动蛋白结合蛋白,其基因结构高度保守,表达广泛,对哺乳动物的生长发育具有重要的作用。FLNa是主要分布在细胞质的大分子蛋白质,最初的研究表明其通过绑束纤维状肌动蛋白,形成动态、立体的的细胞骨架。但最新的临床及实验研究发现FLNa蛋白类似棒状的结构域中的多重片层结构,提供了蛋白质相互作用的界面,是细胞信号转导通路中重要的支架蛋白,多种具有重要功能的蛋白质能与之相互作用。在这些蛋白中许多是膜受体,与细胞的增殖、黏附、迁徙等行为有关。FLNa还参与了肿瘤形成有关的信号转导通路,与肿瘤的发生和发展具有密切关系。本研究第一部分采用免疫组织化学法、RT-PCR和Western bolt法检测FLNa在60例结直肠腺癌患者癌组织及结直肠正常组织标本中的表达情况,并结合临床资料进行分析,探讨FLNa的表达水平与结直肠腺癌的发生发展的相关性。在第二部分实验中,将含FLNa cDNA的质粒载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa以脂质体介导方式转染SW480细胞。经G418筛选,获得FLNa基因稳定表达的SW480/FLNa细胞。RT-PCR和Western blot技术检测FLNa基因的导入情况;MTT法检测SW48细胞的增殖能力;划痕损伤实验、Transwell小室和Matrigel侵袭模型观察SW480细胞侵袭和转移能力的变化,评价FLNa对人结肠癌SW480细胞体外侵袭转移行为的影响。并将细胞接种于裸鼠的皮下,观察其瘤体生长情况;8周后剥除瘤体、称重、计算抑瘤率;观察瘤组织的形态学变化,研究FLNa对SW480细胞在裸鼠体内成瘤的影响。在第三部分实验中,以人结肠癌细胞SW480及SW480/FLNa细胞作为研究对象,观察经EGF和U0126处理后,细胞内FLNa、胞质ERK、细胞核内磷酸化ERK和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平的变化,研究FLNa在ERK信号通路对SW480细胞体外侵袭能力的影响。第一部分FLNa在结直肠腺癌组织中表达及临床意义目的:观察FLNa在结直肠腺癌患者癌组织和正常结直肠组织中的表达情况,探讨FLNa的表达水平与结直肠腺癌的发生发展的相关性。方法:1标本采集:收集河北医科大学第四医院外二科2009年1月–9月60例行手术切除取得的结直肠腺癌组织及结直肠正常组织。腺癌组织切取于肿瘤中心部位(非坏死组织区),而正常结直肠组织的切取部位距肿瘤边缘大于10㎝处。病理诊断确诊所有病例,且无其他部位原发肿瘤,均无化疗、放疗和免疫治疗史。标本取材后,部分置于液氮中速冻,然后转到-80℃冰箱内保存;部分标本用10%甲醛固定,石蜡包埋,作免疫组化染色。2免疫组化检测FLNa在结直肠腺癌及正常结直肠组织中的表达。3结合临床资料进行分析。4 RT-PCR检测FLNa mRNA在结直肠腺癌及正常结直肠组织中的表达水平。5 Western blot检测FLNa蛋白在结直肠腺癌及正常结直肠组织中的表达水平。结果:1 FLNa的阳性表达定位于细胞质。在结直肠腺癌组织的阳性表达率为50.0%(30/60),其中强阳性表达率为11.7%(7/60),弱阳性表达率为38.3%(23/60),而在正常结直肠组织的阳性表达率为91.7%(55/60)(P=0.000<0.05)。2 FLNa的表达水平与结直肠腺癌组织的TNM分期、肝转移、淋巴结转移和肠壁浸润深度具有相关性,而与患者性别、年龄、肿瘤部位、大小、分化程度、肉眼观形态和组织学类型无关。3结直肠腺癌组织中FLNa mRNA的表达水平较正常组织低[(0.24±0.03) vs (0.95±0.04), P=0.017<0.05]。4结直肠腺癌组织中FLNa蛋白表达水平较正常组织低[(0.15±0.02) vs (0.76±0.04), P=0.013<0.05]。结论:1 FLNa的低表达与结直肠腺癌的形成具有相关性。2 FLNa的低表达水平与肿瘤的较晚的TNM分期、肝转移、淋巴结转移和肠壁较深的浸润深度具有相关性。第二部分FLNa对人结肠癌SW480细胞侵袭行为的影响。目的:通过将含FLNa cDNA的质粒转染人结肠癌SW480细胞,过表达细胞内的FLNa基因,研究FLNa对人结肠癌SW480细胞侵袭转移行为的影响。方法:1将FLNa基因质粒载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa,以脂质体介导方式转染SW480细胞。经G418筛选,获得FLNa基因稳定表达的SW480 /FLNa细胞。2 RT-PCR和Western blot技术检测FLNa基因的导入情况。3 MTT法检测细胞体外的增殖能力。4划痕损伤实验检测细胞的迁移能力。5 Transwell小室和Matrigel侵袭模型评价FLNa对细胞侵袭能力的影响。6将SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞接种于裸鼠的皮下,观察其瘤体生长情况。7 8周后进行肿瘤重量分析并计算抑瘤率。8观察瘤组织的形态学变化。结果:1 FLNa的表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa在SW480细胞中获得稳定表达。2 MTT检测结果表明,三组SW480细胞在体外的生长曲线基本重叠,增殖能力无差异。3划痕损伤实验结果表明,SW480/FLNa组细胞缓慢向中央迁移,缺损处修复缓慢,SW480组向划痕处的迁移速度明显快于SW480/FLNa组。4 Transwell小室迁移实验和Matrigel侵袭实验表明,SW480/FLNa组较SW480组穿膜/胶数量明显减少。5 SW480/FLNa组细胞在裸鼠体内的瘤体的生长速度低于SW480组。6 SW480/FLNa组细胞在裸鼠体内的瘤体重量低于SW480组。7 SW480/FLNa组细胞在裸鼠体内的瘤体组织出现明显退变坏死。结论:FLNa能够抑制SW480细胞体外的侵袭能力,并对在裸鼠体内的成瘤具有抑制作用。第三部分FLNa通过ERK信号通路抑制SW480细胞体外侵袭目的:研究FLNa在ERK信号通路对SW480细胞体外侵袭能力的影响,初步探讨FLNa抑癌作用的机制。方法:1采用Western blot法检测ERK抑制剂U0126对SW480细胞质内ERK表达水平的影响。2采用Western blot法检测ERK激活剂EGF对SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平的影响。3以SW480细胞为对照组,采用Western blot法检测经U0126处理20分钟后的SW480细胞和SW480/FLNa细胞的胞质ERK、胞核p-ERK、胞质MMP-9蛋白表达水平。4以SW480/FLNa细胞为对照组,采用Western blot法检测经EGF处理20分钟后的SW480/FLNa细胞和SW480细胞的胞质ERK、胞核内p-ERK、胞质MMP-9蛋白表达水平。5以SW480细胞为对照组,观察经U0126处理20分钟后SW480细胞和SW480/ FLNa细胞的体外侵袭能力的改变。6以SW480/FLNa为对照组,观察经EGF处理20分钟后的SW480/ FLNa细胞和SW480细胞在体外侵袭能力的改变。结果:1经U0126处理5、10、20和30分钟后,SW480细胞质内ERK表达水平分别为0.936±0.030、0.826±0.029、0.130±0.007和0.124±0.001(F=1974.55,P=0.000)。经U0126处理20和30分钟后细胞质内ERK表达水平差异无统计学意义。经U0126处理20分钟后,可对SW480细胞质内ERK表达水平达到最大抑制效果。2经EGF处理5、10、20和30分钟后,SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平分别为0.154±0.018、0.140±0.026、0.832±0.039和0.796±0.034(F=796.488,P=0.000)。经EGF处理20和30分钟后细胞质内ERK表达水平差异无统计学意义。经EGF处理20分钟后,可对SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平达到最大激活效果。3 SW480细胞、经U0126处理20分钟后SW480细胞和SW480/FLNa细胞胞质ERK表达水平分别为:0.500±0.016、0.082±0.013和0.090±0.016(F=1279.433,P=0.000);细胞核p-ERK表达水平分别为:0.439±0.014、0.003±0.001和0.010±0.002(F=5025.294,P=0.000);细胞质MMP-9蛋白表达水平分别为:0.450±0.036、0.004±0.002和0.004±0.001(F=766.091, P=0.000)。4 SW480/FLNa细胞、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa细胞和SW480细胞胞质内ERK表达水平分别为:0.071±0.006、0.758±0.075和0.808±0.058(F=279.252,P=0.000);胞核内磷酸化ERK表达水平分别为:0.021±0.002、0.260±0.004和0.269±0.010(F=2325.506,P=0.000);胞质内MMP-9表达水平分别为:0.012±0.005、0.615±0.036和0.594±0.018(F=1086.979,P=0.000)。5 SW480细胞、经U0126处理20分钟后SW480细胞和SW480/FLNa细胞的穿膜细胞数分别为214±5、81±2和77±3(F=1340.740,P=0.000),经U0126处理20分钟后SW480组低于SW480组(P=0.000),SW480/ FLNa组低于SW480组(P=0.000)。6 SW480/FLNa细胞、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa细胞和SW480细胞的穿膜细胞数分别为54±3、126±2和129±3(F=731.379, P=0.000),经EGF处理20分钟后SW480/FLNa组高于SW480/FLNa组(P=0.000),SW480组高于SW480/FLNa组(P=0.000)。结论:FLNa抑制结肠癌SW480细胞侵袭转移能力的机制是通过抑制ERK信号通路,减少MMP-9蛋白的合成,降低肿瘤细胞对基底膜的降解,最终阻遏癌细胞的侵袭。