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胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是由70个氨基酸组成的单链多肽，主要由肝脏分泌。大量研究表明，IGF-1是一种多功能细胞增殖和调控因子，具有广泛的生物学功能，介导生长激素对细胞分裂和代谢的大部分作用。人体的几乎所有细胞都受IGF-1的影响，尤其是肌肉细胞、软骨细胞、骨细胞、心脏细胞、肾细胞、神经细胞、皮肤细胞和肺细胞。近年来IGF-1已用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合征、侏儒症、某些神经系统疾病和某些顽症，临床效果令人鼓舞。由于IGF-1在人和动物体内含量非常低，靠分离天然物质无法满足基础研究和临床利用需要，因此，通过重组DNA技术生产具有生物活性的IGF-1就成为一种必然。IGF-1已在细菌和酵母表达系统中得到表达，但在这两种系统中，大多数重组蛋白不能正确折叠，常常以无活性的包涵体形式聚集。转基因动物和哺乳动物细胞培养体系也存在一些不利的因子，如存在人畜共患病传染的危险、表达产物妨碍宿主正常生长等。植物是一种IGF-1潜在的表达系统，它有可能用于重组IGF-1的规模化生产，但这方面的研究工作刚开始起步。 本项目根据甘蓝(Brassica oleracea var. capitata L. )基因密码偏爱性，对IGF-1基因DNA序列进行了修改，根据优化的序列，人工半合成了该基因。同时从烟草(Nicotiana tabacum L.)和甘蓝中各克隆了一段MAR分子，通过转基因测定分析，两段MARs均能显著提高转基因表达水平，因此，被用于构建IGF-1高效植物表达载体，并首次将IGF-1基因导入甘蓝，成功获得了IGF-1转基因甘蓝新材料，为将甘蓝开发成一种具有治疗作用的药用蔬菜开辟了道路。研究工作主要包括以下几个方面： 1 核基质结合区(Matrix attachment regions, MARs)的分离 核基质结合区(MAR)是能将染色质固定在核基质上(即能与核基质特异性结合)的一段DNA序列，长度通常为300～1000bp，广泛分布于真核生物基因组中，并将真核基因组在结构和功能上分成相对独立的1oop单位。MAR不仅使染色质形成了环形结构，还能作为DNA复制的起点，并能调节真核细胞中的基因表达。由于MAR在转基因动植物中能消除转基因沉默，提高转基因的表达水平，近年来已引起了人们极大的关注。本实验采用CTAB法提取了烟草和甘蓝基因组DNA。根据报道的烟草MAR序列，设计引物P1／P2，为便于表达载体构建，在引物P1的5′端引入了HindⅢ-EcoR Ⅰ酶切位点，通过PCR方法克隆这段MAR分子。为了比较不同来源MARs对转基因表达的影响。根据油菜基因组中短散布元件(SINE)序列设计了引物P3／P4，引物P3的5′端添加了EcoR Ⅰ-HindⅢ酶切位点，PCR方法分离该MAR片段。序列测定结果表明，来自烟草的MAR长度为688bp，AT含量为73.1％，而甘蓝MAR长度为527bD，AT含量为74.8％，两段序列均含有“90％AT box”及其它MAR的特征基序。 2 GUS表达载体的构建 为了分析和比较不同来源的MARs对转基因表达的效果，本实验构建了以CaMV 35S为西南农业大学博士学位论文，巴里早毕早毕里巴里口巴巴里口绝启动子，T-NOS为终止子，携带了MAR的和不携带MAR的GUS表达载体。构建过程中先用了劲，dlllz石沁oRI消化质粒pBllZI，切下表达盒，插入pBINPLUs的2去”dlll/EcoRI位点，得到新的植物表达载体pBGUs。通过单酶切，依次将烟草MAR插入pBGUS表达盒两侧的EcoRI位点和从力dnl位点，每次连接之前载体先进行去磷酸化处理，以防自连环化。设计P一355的卜游引物(Pp)和不NOS的上游引物(Pt)，插入MARs后用PCR方法鉴定其方向，选择MARs成顺式重复的转化子，经酶切和PCR鉴定为阳性克隆后，得到新的植物表达载体.命名为pBMGUSMI(MAR一p35s一GUS一TNOS一MAR)。用同样的方法，依次将甘蓝MAR插入pBGUS表达盒两端的去斤”dm位点和石七。Rl位点，选择MARs方向相同的重组质粒，酶切和pCR检测为阳性的，命名为PBMGUSMZ。3 Gus转基因烟草的获得及活性侧定 为检测和比较不同MARS对转基因植株中转基因表达的效果，将所构建的携带MAR和没携带MAR的3个GUs表达载体，用农杆菌介导的叶盘法转化烟草。在Ms十2.5m岁LBA+0.5m留L IAA+l oom泌kan.+25Om叭Cb.上筛选培养，形成不定芽后转到相同的筛选培养基上再次进行筛选，淘汰掉少数逃逸筛选的不定芽.为保证所获得的植株都是独立的转化体，每个外植体上只取一个芽.所获得的转化苗在Ms附加loom叭kan.的培养基中生根.按照Jefferson方法，以四甲基伞形酮p一D一葡萄糖普酸作底物，荧光分光光度计定量测定转基因烟草中的GUS表达活性。蛋白质含量按Bradford的方法，用分光光度计测定。为减少误差，每个植株均取距顶端第4片叶，每个转化群体各取25株，未转基因植株作对照，取10株。GUS活性以四甲基伞形酮(4一Mu)的纳摩尔数与总蛋白质含量及时间的比值(nmol Mu·mg一’protein，min’’)表示。结果表明，无论是来自烟草的MAR还是甘蓝的MAR，构建到表达框两翼后，均显著提高了GUs基因的表达活性。与pBGuS转化群体相比，来自甘蓝的MAR使GUS的表达活性平均提高了2倍;而构建了烟草MAR的表达载体，使GUS的表达活性平均提高了1.5倍。测定结果还表明，无论是来自甘蓝的MAR还是来自烟草的MAR都不能降低不同?