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研究背景与目的: 小电导-Ca2+-激活 K+通道(small-conductance calcium-activated potassium channels, SK，Kca2)可以表达在几乎所有的可兴奋细胞的细胞膜上。SK2通道是哺乳类动物心脏中表达的一种重要的离子通道，在心肌细胞动作电位复极化中起着关键作用，尤其是在复极晚期。已有的研究表明，SK2通道的激活是通过细胞内的钙离子连接钙调蛋白，通过诱导通道的构象改变从而引起通道开放。细胞外的钙离子是通过细胞膜上的钙离子通道得以进入细胞内从而调节 SK2通道的开放，然而细胞内肌浆网膜上的兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyRs）敏感的钙释放也会影响到SK2通道的功能。 细胞膜表面与肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR/ER）离子通道之间的功能交通是可兴奋细胞的一个重要特征，而位于两者之间的耦联膜复合体（junctional membrane complexes，JMCs）是实现其交通的结构基础。Junctophilin（JP，JPH）是参与形成耦联膜复合体的一个蛋白分子，其主要功能是在耦联膜复合体中使细胞膜和肌质网之间维持一个相对固定的距离，从而为细胞膜与肌浆网之间的信号转导提供了结构基质。在哺乳动物的基因组中，JPH的4个组织特异性基因亚型分别为 JPH1, JPH2, JPH3, JPH4，JPH2是作为一种调节心肌细胞兴奋-收缩耦联的关键分子存在。目前的研究表明，JPH2对于调定细胞膜上电压门控钙离子通道和内质网膜上的RyR之间的空间距离起着决定性作用。 本实验室之前的工作已经证明小鼠心房肌组织中存在JPH2和SK2蛋白，而且JPH2与SK2通道蛋白可以形成免疫共沉淀复合物，提示心肌组织JPH2与SK2通道之间可能存在着相互作用；通过构建靶向 JPH2-shRNA重组慢病毒载体，发现慢病毒载体Lenti-siJPH2可减低新生小鼠心肌细胞JPH2 mRNA和蛋白的表达；进一步研究发现敲减 JPH2可抑制心肌细胞 SK2蛋白的表达。那么，干扰JPH2的表达是否影响SK2通道的功能？ 本研究拟通过靶向腺病毒JPH2siRNA干扰心肌细胞JPH2的表达，采用全细胞膜片钳的方法来检测敲减JPH2以后对心肌细胞SK2通道介导的K+电流的影响，确定JPH2对新生小鼠心肌细胞SK2通道功能的调控。 材料方法： 1)本实验采用出生1-3d的C57BL/6小鼠（合格证号为SCXK（京）2012-0001）购于北京维通利华实验有限公司，雌雄不限。 2)采用本实验室已具有的针对小鼠JPH2mRNA的靶序列(19nt shRNA片段)，在双酶切作用下和psiAD-hU6-EGFP载体进行重组，制备表达JPH2-shRNA的重组腺病毒表达载体，通过 PCR和阳性克隆测序对重组子进行鉴定，将鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293T细胞，得到了能够具有感染能力的pAD-JPH2-siRNA重组腺病毒； 3)培养新生小鼠心肌细胞被划分为非感染对照组（ Ctrl-NC）、无关对照组（AD-NT）和重组腺病毒感染组(AD-JPH2-siRNA)，通过流式细胞术来检测重组腺病毒的转染效率； 4)采用Western blot和全细胞膜片钳技术来记录各组转染重组腺病毒48h后，心肌细胞 SK2通道蛋白的表达及单个新生小鼠心肌细胞 Ca2+激活 K+电流（Ik,Ca）的变化； 5)统计学处理：采用统计学软件 SPSS17.0对实验数据进行医学统计学分析，并采用单因素方差分析的统计方法对不同组别进行两两比较，以α=0.05为检验水准。 结果： 1) PCR和阳性克隆测序证实了重组JPH2腺病毒表达载体已经构建成功； 2) 流式细胞仪检测表明MOI值为100时，AD-NT组、pAD-JPH2-siRNA感染组对原代培养小鼠心肌细胞的感染效率分别为76.9％、75.4%； 3) Western blot技术检测蛋白表达量，表明转染了AD-JPH2-siRNA重组腺病毒的新生小鼠心肌细胞JPH2及SK2蛋白的表达明显抑制； 4) 全细胞膜片钳记录各组细胞的Ik,Ca，与正常对照组和AD-NT-siRNA组相比较，AD-JPH2-siRNA重组腺病毒感染的新生小鼠心肌细胞中，所测得的SK2通道介导的K+电流明显降低。 小结： 本实验将已构建成功的针对JPH2基因的siRNA重组腺病毒载体转染新生小鼠心肌细胞，通过干扰JPH2基因的表达可显著抑制SK2蛋白的表达并降低心肌细胞Ca2+激活K+电流。