心肌钠-钙交换体基因片段的克隆与表达和抗α重复序列抗体的制备与功能特性的研究

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钠-钙交换体(sodium-calcium exchanger,NCX)是一类广泛存在于心、脑、肾、骨骼肌、胰腺等各种组织细胞的跨膜蛋白质,一般认为,NCX在心肌的主要作用是在舒张期排出Ca2+,维持细胞内Ca2+稳态。但是NCX在正常和病理情况下心肌中全面的功能作用一直没有明确的研究结果,其主要原因之一是缺乏特异性的NCX抑制剂和激动剂。本课题的主要目的是想得到NCX的免疫性抗体,包括抑制性抗体和激动性抗体。这些抗体可作为工具药进行NCX功能特性的研究,也有可能成为临床心脏疾病诊断和治疗的新途径。我们以NCX分子中对Na+和Ca2+转运起关键作用的肽段作为抗原,以期得到效应明显、特异性高的抗体。根据目前对NCX蛋白分子结构—功能关系的研究,与阳离子转运密切相关的部位主要存在三个部位,即第4、5跨膜段和α-1、α-2重复序列。针对这三个区域,我们尝试通过两种不同的技术路线来完成抗体的制备。在本研究的第一部分,通过NCX基因片段克隆和表达的方法得到抗原:在本研究的第二部分,采用人工合成的肽段作为抗原,制备抗血清和纯化抗体。 第一部分 狗钠-钙交换体基因在大肠杆菌中的克隆和表达 1990年Nicoll和Phillipson首次报道了狗NCX cDNA序列,山1厅医料大学2003博d二喇六泊立宝仑文该序列全长2910 bp,共编码970个氨基酸,氨基端前32个氨基酸为前导肤序列,其功能与新生的NCX在胞浆中的运输和在细胞膜<sub>匕的定位有关,因此成熟的NCX共含938个氨基酸。通过对心肌NCx与钠一钾泵氨基酸序列的比较发现,心肌NCX第4,5跨膜段之间的细胞外环第180一203位氨基酸残基与钠钾泵第308一331位氨基酸残基之间存在高度同源性。对该段氨基酸残基定点突变体的研究表明,第199位谷氨酸残基和203位苏氨酸残基的突变导致了NCX钠一钙交换功能的丧失,从而证明该片段对钠一钙交换体发挥其功能具有重要作用。为了最终针对此肤段制备免疫性抗体,本文运用分子生物学的方法,克隆并表达了NCX cDNA从418到996bp间的片段。材料与方法 用RT一PCR方法从狗脑组织中扩增得到NCX cDNA片段,将其用载体pGEM一T Easy克隆和亚克隆,并经DNA序列分析正确后插入融合表达载体pET一28b(+)中,构建原核表达菌株并诱导表达。结果 原核表达菌株于37“C经IPTG诱导3h后,15%SDS一PAGE显示,在分子量约26kd处有一特异蛋白表达带,与融合蛋白的预期分子量一致,而未经诱导的细菌无特异条带产生。结论 运用分子克隆的方法在大肠杆菌中表达了NCX片段,表达产物相当于NCX第2、3、4、5跨膜段,其中含有钠一钙交换的关键部位一第199位谷氨酸残基和203位苏氨酸残基。用此肤段作为抗原,为免疫动物制备抗NCX多克隆和单克隆抗体,并用于研究它们对于山西医科大学2003博d匕学位论文心肌细胞钠一钙交换功能的影响奠定了基础。第二部分心肌钠一钙交换体Q重复序列抗体对成年大鼠心肌电活动和机械活动的影响 上世纪九十年代以来,随着NCX分子克隆的成功,NCX结构一功能关系的研究取得了很大的进步。1990年Nicoll等从狗的心脏中克隆出NCX,并启动了对NCX的分子生物学研究。随后Schwarz和Ronzer于1997年发现,在迄今为止所有已知的NCX中都存在有进化上高度保守的重复序列,并将其命名为Q一1和a一2(a一1 and一2 rePeats)。在心脏型NCX,。一1主要位于第2,3跨膜段及其之问的氨基酸序列,而Q一2主要位于第7跨膜段及其C端的氨基酸序列。遗传学理论认为,分子内的重复来源于基因内部的复制,而且只有对蛋白质分子执行功能必不可少的重复序列才能在进化过程中稳定存在。如上所述,由于Q一1和。一2重复序列在各种已知的NCx普遍存在,说明它们对NCX的功能起着必不可少的作用,其后的实验研究也证实了这一点。NCX的a一重复序列一经发现,便受到了众多研究者的广泛重视。对NCXa一1和a一2的突变体功能研究认为,。重复序列在转运底物(Na‘和CaZ‘)、NiZ‘、Li‘及KB一R7943与NCX相互作用中起关键作用;工wamoto等对NCX跨膜结构的分析表明,心肌细胞膜NCXa一1和Q一2分别位于膜的两侧,且都有中间部分序列位于膜内、两端在膜表面,形成了所谓的“reentrant loop”,并且进一步推测。一1和Q一2参与构成了该转运体的离子转运通路。 既然Q重复序列是NCX发挥功能的关键部位,那么针对该重复山龟叮医科大学2003博士.学亡比论文序列的抗体就有可能成为NCX的特异性激动剂或抑制剂。尤其是针对‘NCX的特异性激动剂,目前还没有一种可供研究应用。为此,木研究分别运用人工合成的a一l和a一2重复序列免疫大鼠获得抗血、清,并经亲和纯化,然后观察了抗Q一1和Q一2两种抗体对成年大鼠心肌细胞钠一钙交换功能的影响,如能得到预期结果,就可以将它们用于心肌钠一钙交换功能的研究。最后,运用离体心脏灌流的方法,观察了抗a一1和Q一2两种抗体分别对成年大鼠离体心脏心功能的影响。一抗Q一1和抗Q一2抗体的制备和纯化研究用的a一1和Q一2重复序列分别由华中科技大学同济医学院和西安美联生物科技有限公司合成,氨基酸序列如下:SVI
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