柑橘碎叶病毒和香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用

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制备重要植物病毒的特异性抗体、建立相应的血清学检测方法对植物病毒的检测及其口岸检验检疫和科学防治具有重要意义。柑橘碎叶病毒(Citrus Tatter Leaf Virus, CTLV)为我国继柑橘衰退病和裂皮病之后的一种重要的柑橘病毒病之一,而香蕉束顶病毒(Banana Bunchy Top Virus, BBTV)引起的香蕉束顶病是香蕉上的重要病害,其威胁着包括亚洲、非洲、南太平洋地区约占世界四分之一香蕉的生产。本论文分别制备了抗CTLV和BBTV的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies, MAbs),并建立了相应的的血清学检测方法。(1)抗CTLV单克隆抗体制备及其检测应用:用PCR方法从感染CTLV的柑橘基因组中克隆了该病毒的外壳蛋白(Coat protein, CP)基因,将其插入到原核表达载体PET-28a中构建成重组原核表达载体。重组表达载体PET-28a-CP转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+-NTA亲和柱纯化获得分子量约为30kDa的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,获得3株能稳定传代并分泌抗CTLV的单克隆抗体杂交瘤细胞。分泌的单抗特异性检测表明3株单抗能特异性识另JCTLV。利用3株单抗建立了检测CTLV的dot-ELISA方法,该方法检测病叶的灵敏度可达1:640(w/v, g/mL)。(2)抗BBTV单抗制备及其检测应用:将经BBTV病毒粒子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经细胞筛选与克隆,获得1株能稳定传代并分泌抗BBTV单克隆抗体的杂交瘤细胞22E3,并制备其单抗腹水。该单抗可以特异性地与BBTV反应,利用单抗为核心建立了检钡BBTV的抗原包被间接ELISA方法(antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbent assay, ACP-ELISA)和免疫斑点法(dot-ELISA).建立的dot-ELISA方法检测感染的香蕉植株组织的灵敏度达1:320(w/v, g/mL)
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