干旱是一种严重制约棉花品质和产量的自然灾害。因此,改善棉花品质,提高棉花产量,必须提高棉花的抗旱能力,培育抗旱棉花新品种,这是目前棉花育种工程亟需解决的问题。新疆作为我国棉花的主要产区之一,受干旱胁迫的影响极大。干旱作为非生物胁迫的首要因子,已经严重影响到新疆棉花的生产。因此,借助基因工程技术及分子生物学的方法对棉花抗旱机理进行深入研究,进一步发掘和克隆对棉花抗旱有紧密关系的基因,对于抗旱棉花新品种的培育具有重大意义。本研究前期通过比较蛋白质组学的方法发现棉花HSP70、V-H~+-ATPase A亚基在干旱胁迫前后蛋白表达量差异显著,初步确定其与植物抗旱性有关。本研究以抗旱棉花品种“KK1543”为材料,以质谱分析得到的序列设计特异性引物,克隆获得基因cDNA全长,将棉花HSP70命名为GhHSP70-26,液泡膜H~+-ATPase命名为GhVHA-A。利用荧光定量PCR方法对两个基因的表达模式分析,并通过烟草农杆菌转化技术和VIGS技术对这两个基因功能做了进一步分析。从分子水平阐明这两个基因可能的作用机理。本研究获得的主要结果如下:(1)根据拟南芥17条HSP70基因序列,在陆地棉基因数据库比对获得53条GhHSP70序列,用生物信息学的方法分析比对陆地棉GhHSP70基因家族。结果表明陆地棉HSP70蛋白均含有三个典型的HSP70签名基序序列,高度保守;每条染色体上GhHSP70基因的分布不均匀;同时可将陆地棉、拟南芥和可可植物热激蛋白HSP70家族成员分为4个亚家族:质体间质亚族(Plastid Stroma)、线粒体亚族(Mitochondrial Matrix)、内质网亚族(Endoplasmic Reticulum)和细胞质亚族(Cytosol);同时还发现该蛋白没有跨膜区,其二级结构包括α-螺旋、β-折叠、转角和无规则卷曲。(2)表达模式分析发现GhHSP70-26在叶片中的表达量比根、茎中的高,受干旱、高温、高盐和ABA诱导表达。不同棉花材料叶片中GhHSP70-26的表达量与棉花抗旱系数呈正相关。原核表达结果显示,在不同时间及不同浓度IPTG诱导剂均能获得GhHSP70-26蛋白。(3)干旱处理后,利用VIGS技术沉默GhHSP70-26的棉花植株表现出与对照植株相比离体叶片水分丧失快、叶片MDA含量和电导率增大的变化,而叶绿素含量和总抗氧化物酶活性又低于对照,这说明沉默GhHSP70-26基因使VIGS植株抗旱性减弱,与对照植株相比更易受到干旱的迫害。(4)在干旱胁迫下,过表达GhHSP70-26能提高转基因烟草的存活率,能够减少转基因烟草叶片水分丧失来增强转基因烟草的干旱忍耐能力。同时GhHSP70-26通过降低转基因烟草细胞膜受损程度和减轻转基因烟草细胞受ROS氧化胁迫的伤害来提高转基因烟草的抗旱性。(5)通过酵母双杂交技术初步获得与GhHSP70-26蛋白的互作蛋白为棉花抗坏血酸氧化酶(APX)。GhHSP70-26上游启动子序列分析发现启动子区域含有ABA响应元件和高温应答元件。酵母单杂实验表明转录因子GhbZIP和GhHSF特异结合GhHSP70-26启动子中的ABRE和HSE元件,说明GhHSP70-26可能受以上两个转录因子调控。(6)通过RT-PCR的方法克隆棉花V-H~+-ATPase A基因,命名为GhVHA-A。该基因完整开放阅读框为1872 bp,编码623个氨基酸残基蛋白,预测分子量大小为68.41 kDa,理论等电点为5.17。发现棉花V-ATPase A亚基与大豆、拟南芥、小麦和可可等植物的V-ATPase A亚基具有较高的相似性和同源性,与可可的VHA-A在进化上亲缘关系较近。同时V-ATPase A亚基是一个高度保守的蛋白亚基,存在两个保守的结构域:GAFGCGKT和PSVNWLISY。(7)表达模式分析表明GhVHA-A在棉花茎组织中的表达量最高。GhVHA-A受高盐,脱水(PEG),低温和外源ABA胁迫诱导表达。不同棉花材料叶片中GhVHA-A基因的表达量与棉花抗旱性呈正相关。(8)VIGS技术沉默棉花GhVHA-A的研究显示,沉默GhVHA-A的棉花植株表现离体叶片水分丧失快、叶片MDA含量和电导率增大,而叶绿素含量和总抗氧化物酶活性降低,这说明沉默GhVHA-A基因使棉花植株对干旱胁迫更敏感,受伤害程度加大。(9)过表达GhVHA-A基因可以使转基因烟草离体叶片的水分丧失量减少,在干旱胁迫下,转基因烟草的存活率明显高于非转基因烟草,表明过表达GhVHA-A基因能增强转基因烟草的干旱忍耐能力。同时GhVHA-A还可以通过增加转基因烟草液泡中渗透调节物质的积累,可能通过促进转基因烟草根系生长来提高转基因植株的抗旱性。(10)表型观察过表达GhVHA-A的转基因棉花发现转基因棉花具有根系发达,侧根数量多的特点,说明GhVHA-A基因可能在根系的生长发育过程中起重要作用。