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一、研究目的1.体内实验采用人肝癌H22细胞小鼠移植瘤模型观察叶下珠复方Ⅱ号的抑瘤作用效果,通过检测移植瘤小鼠的外周血象、肝肾功能水平,结合观察药物对小鼠脾指数和胸腺指数的影响,评价其对化疗的增效减毒作用效果。2.体外实验观察叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用及对细胞周期的影响；观察叶下珠复方Ⅱ号通过调控miR-122的表达、抑制靶基因IGF-1R mRNA及蛋白质的表达、进而抑制下游PI3K/AKT/mTOR信号通路活化的作用效果,从分子水平探讨其抗肝癌作用的靶点和机制。二、实验内容1.叶下珠复方Ⅱ号对小鼠H22移植瘤化疗的增效减毒作用的研究建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,随机分为6组：模型组、叶下珠复方Ⅱ号高剂量组、低剂量组、环磷酰胺治疗组、叶下珠复方Ⅱ号(高、低剂量)+环磷酰胺组。连续给药8天,于末次给药后24 h,检测各组小鼠抑瘤率、肝肾功能、胸腺和脾脏指数。结果显示叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量联合环磷酰胺组瘤重均明显低于模型对照组(P<0.01)；叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量与环磷酰胺合用后,抑瘤率分别为74.3%和66.9%,均大于两药合用的理论相加效应值(Fa)1.272.2%和64.8%,提示两药合用后对抑瘤作用有所提高,有明显的协同增效的作用。叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组的胸腺指数、脾脏指数均明显高于环磷酰胺组,差异有显著性意义(P<0.05)；叶下珠复方Ⅱ号高剂量联合环磷酰胺组脾指数高于环磷酰胺组(P<0.05),但胸腺指数差异均无显著性意义(P>0.05)；且小鼠的血清ALT、AST、CRE、UREA水平均明显低于环磷酰胺组,差异均有显著性意义(P<0.05),表明叶下珠复方Ⅱ号在抑瘤的同时能提高小鼠机体非特异性免疫,在一定程度上改善环磷酰胺所致的免疫器官萎缩,并且能有效地改善化疗药物所致起的肝肾功能损害。2.叶下珠复方Ⅱ号抗肝癌的药效作用及机理研究2.1叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌Huh-7细胞的增殖抑制作用研究体外实验选用人肝癌Huh-7细胞,运用MTT法,测定叶下珠复方Ⅱ号对Huh-7细胞增殖抑制作用,结果显示叶下珠复方Ⅱ号能明显地抑制人肝癌Huh-7细胞株的增殖,其作用有明显的量-效关系,其48h的1C50为58.6mg/m]；而且叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组在24h、48h、72h三个时间段内对人肝癌Huh-7细胞的增殖都有明显的抑制作用,与对照组相比,结果有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。2.2叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌Huh-7细胞细胞周期的影响研究叶下珠复方Ⅱ号干预Huh-7细胞48h后,流式细胞仪检测细胞周期的变化,与对照组相比,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组G0/G1期细胞的比例显著增加,S期、S期+G2/M期细胞的比例明显降低,差异均有显著性意义(P<0.01)。2.3叶下珠复方Ⅱ号对人肝癌Huh-7细胞miR-122、IGF-1RmRNA及其蛋白质、PI3KmRNA、AKT2mRNA、mTORmRNA、cyclinD1mRNA、P-AKt蛋白质表达的影响叶下珠复方Ⅱ号作用Huh-7细胞48h后,与对照组相比,叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组中miR-122的表达显著增高、而IGF-1RmRNA及其蛋白表达明显降低(P<0.01),且叶下珠复方Ⅱ号高、低剂量组PI3KmRNA、AKT2mRNA、mTORmRNA、cyclinD1mRNA和P-AKt蛋白质表达均明显降低,与对照组比较,差异均有显著性意义(P<0.01)。显示叶下珠复方Ⅱ号通过提高miR-122的表达,抑制其靶基因IGF-1R的mRNA和蛋白质的表达,从而抑制下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化,导致细胞周期蛋白cyclinD1的表达减少,使肝癌细胞的增殖受到抑制。三、结论1.叶下珠复方Ⅱ号对H22移植性肝癌模型小鼠有明显的抑瘤作用,联合化疗药物使用时,能增强化疗药对肿瘤的杀灭作用,并能减轻化疗药的毒副作用。其作用机制与提高机体非特异性免疫,改善化疗中免疫器官萎缩和肝肾功能损害有关。2.叶下珠复方Ⅱ号对肝癌Huh-7细胞的增殖有明显的抑制作用,能显著地阻滞Huh-7细胞的细胞周期进程,使细胞大多停留在G0/G1期,不能进入S期进行DNA合成,最终使癌细胞的增殖受到抑制。同时,叶下珠复方Ⅱ号能明显地提高肝癌Huh-7细胞中miR-122的表达,从而使靶基因IGF-1R的mRNA和蛋白质表达减少,导致下游联级反应中的PI3K、AKT、P-AKt、mTOR的表达受到抑制,从而抑制相应的PI3K/AKT /mTOR信号通路活化,导致细胞周期蛋白cyclinD1的表达减少,抑制肝癌细胞的增殖。