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目的：观察加兰他敏对β淀粉样蛋白的生成以及β淀粉样蛋白生成途径的底物(APP)和关键酶(BACE1)的影响，探讨加兰他敏干预β淀粉样蛋白生成的机制；观察加兰他敏对β淀粉样蛋白诱导的细胞损伤后Calpain-Calcineurin通路活化的拮抗作用，进一步探讨加兰他敏抗β淀粉样蛋白损伤的神经保护机制。
方法：实验分两个部分，第一部分实验采用10μmol/L维甲酸诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞分化6天，获得类神经元样细胞，将其分为对照组、加兰他敏(0.3，0.9，10μmol/L)作用组，在用药后不同时间(6h，12h，18h，24h)分别应用夹心酶联免疫分析法检测各组细胞培养上清中Aβ1-40和Aβ1-42的水平，应用免疫蛋白印迹技术检测各组APP，sAPPa，BACE1表达的变化。第二部分实验采用5μmol/L Aβ1-40孵育SH-SYSY细胞24h，建立细胞损伤模型，倒置显微镜下观察细胞形态，应用噻唑蓝比色法(MIT)检测细胞活力，并利用免疫蛋白印迹技术检测Calpain I，Calcineurin A，Bad，Ps112Bad的表达情况，免疫荧光双标法检测Calpain I，Calcineurin A的共表达。提前24h应用0.3μmol/L加兰他敏与10nmol/L MLA(a7烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂)对上述Aβ1-40处理的细胞进行干预，观察上述指标的变化。
结果：第一部分：1、10μmol/L维甲酸诱导SH-SYSY细胞分化6天，细胞分化为类似神经元样细胞。2、经不同浓度加兰他敏(0.3-10μmol/L)作用细胞6-24h后，各组细胞培养上清中Aβ1-40和Aβ1-42的释放水平呈不同程度的下降，呈现一定的剂量和时间相关性，与对照组比，加兰他敏10μmol/L作用18h组Aβ下降最为显著，Aβ1-40降为对照组的68.09％(P<0.001)，Aβ1-42降为对照组的63.06％(P<0.001)。3、加兰他敏作用细胞18h，细胞培养上清中sAPPa的水平增加，呈现明显的剂量相关性，加兰他敏浓度为10μmol/L时作用最为显著，sAPPa的分泌是基础条件下的2.4倍(P<0.001)。4、加兰他敏作用细胞18h可以抑制细胞内BACE1的表达，浓度为0.3μmol/L时作用最为显著，BACE1的表达为对照组的44％(P<0.001)。5、加兰他敏对细胞内APP的表达无显著影响(P>0.05)。第二部分：1、5μmol/L Aβ1-40孵育SH-SY5Y细胞24h之后，细胞损伤明显，细胞的存活率降到65.98±2.52％，与对照组相比差异显著(P<0.01)；免疫蛋白印迹显示细胞内calpain I和Calcineurin A裂解显著增加，活性片段与全长片段的比例分别增加至2.85±0.17和1.04±0.05，与对照组(0.08±0.04和0.07±0.01)相比差异显著(P<0.01)；细胞内Ps112Bad水平下降到对照组的52.1％，统计学差异显著(P<0.01)；间接免疫荧光显示细胞浆内Calpain I和Caleineurin A表达显著增强。2、在Aβ1-40孵育之前给予0.3μmol/L加兰他敏作用24h，细胞损伤程度减轻，细胞的存活率升到90.97±2.79％，Calpain I和Calcineurin A的活性片段与全长片段的比例分别降至0.10±0.03和0.12±0.02，Ps112Bad水平为对照组的74.2％，与Aβ1-40单独处理组均有显著差异(P<0.01)；间接免疫荧光显示细胞浆内Calpain I和Calcineurin A荧光信号强度，与Aβ1-40组相比均降低。3、在加兰他敏预处理同时加入10nmol/LMLA，加兰他敏保护作用消失，细胞损伤程度与Aβ1-40单独处理组相近，细胞存活率(70.76±3.97％)与加兰他敏保护组相比显著减低(P<0.01)；Calpain I和Calcineurin A的活性片段与全长片段的比例(2.64±0.13和0.92±0.05)与加兰他敏保护组相比显著增加(P<0.01)；Ps112Bad水平为对照组的58.8％，与加兰他敏保护组相比差异显著(P<0.01)；间接免疫荧光显示细胞浆内Calpain I和Calcineurin A荧光信号强度，与加兰他敏保护组相比表达增强。
结论：1、加兰他敏可以降低分化的SH-SY5Y细胞外Aβ1-40和Aβ1-42的分泌，增加s APPa释放，加兰他敏对于Aβ水平的调节与其抑制BACE1的表达，减少APP经Aβ生成途径代谢有关。2、Aβ1-40损伤后SH-SY5Y细胞中Calpain I，Calcineurin A表达及裂解增加，磷酸化的Bad(Ps112Bad)表达减少，提示Aβ1-40诱导的细胞损伤与活化Calpain-Calcineurin通路使细胞进入凋亡途径有关。3、加兰他敏能拮抗Aβ1-40诱导的细胞损伤，其保护机制可能与抑制Calpain I，Calcineurin A蛋白的活化，提高Bad的磷酸化水平，进而阻止细胞进入凋亡途径有关，a7烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂MLA能逆转加兰他敏的上述保护作用，提示a7烟碱型乙酰胆碱受体参与加兰他敏的保护作用。