两种海洋双壳贝类多不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆与功能鉴定

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多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFA)指双键数>2且碳原子数>18的直链脂肪酸,而双键数>3且碳原子数>20的PUFA则称为高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acid, HUFA)。其中具有重要生理功能的PUFA主要有花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),它们是生物体正常生长发育的必需脂肪酸。研究表明,海产贝类富含PUFA,但是不具有或具有非常微弱的PUFA合成能力。近年来,陆续从章鱼(Octopus vulgaris)、鲍(Haliotis discus hannai Ino)中克隆得到脂肪酸去饱和酶(Fatty acid desaturase, FAD)和脂肪酸碳链延长酶(Elongtion of very long chain fatty acid protein, ELOVL),填补了软体动物PUFA合成途径中关键酶基因研究的空白。本文对两种华南地区重要海水养殖品种:华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)和葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)的FAD和ELOVL基因进行克隆和功能鉴定,并对其组织表达特性进行研究,另外研究了华贵栉孔扇贝FAD基因在胚胎发育过程中的表达量变化。主要结果如下:  1、采用RT-PCR和RACE-PCR方法,从华贵栉孔扇贝和葡萄牙牡蛎中分别克隆得到一个FAD基因和一个ELOVL基因。扇贝FAD基因cDNA全长为1714bp(不含polyA),1287bp的开放阅读框编码了428个氨基酸,理论等电点为8.80,预计蛋白质分子量大小为50.5 KDa。牡蛎FAD基因cDNA全长1551bp,1311bp的开放阅读框编码437个氨基酸,理论等电点为8.37,预计蛋白质分子量大小为51.0 KDa。氨基酸序列与哺乳动物去饱和酶基因FADS1(Δ5)和FADS2(Δ6)拥有48%-53%相似性,与多种硬骨鱼的FAD的相似度为48%-51%。具有典型的FAD的结构特性。经功能鉴定,扇贝FAD基因的表达产物具有Δ5 FAD去饱和酶活性,牡蛎FAD基因的表达产物无明显功能。  2、扇贝Elovl基因cDNA全长为1291bp,924bp的开放阅读框编码307个氨基酸,理论等电点为9.46,预计蛋白质分子量为36.1 KDa。牡蛎Elovl基因cDNA全长1433bp,930bp的开放阅读框编码310个氨基酸,理论等电点为9.52,预计蛋白质分子量大小为36.0 KDa。氨基酸序列与其他物种延长酶的序列相似度为42%-45%。具有典型的碳链延长酶的结构特性,经功能鉴定,该两个基因的表达产物具有碳链延长活性,功能和进化上与脊椎动物Elovl5较接近。  3、采用Real-Time PCR检测上述四个基因的组织表达特性。华贵栉孔扇贝Δ5 FAD基因在所有组织中都有表达,在性腺和肝胰腺中表达量最高,其次分别是外套膜、血液、鳃、肾脏和肠道,在闭壳肌中表达量最低。扇贝Elovl基因在所有检测的组织中也都有表达,但是在血液中表达量最高,其次分别是性腺、外套膜、肝胰腺、肠道和鳃,在肾脏和闭壳肌中表达量最低。葡萄牙牡蛎Δ5 FAD基因在检测的所有组织中都有表达,在外套膜和鳃中的表达量最高,其次是性腺,在闭壳肌中的表达量最低。牡蛎Elovl在鳃和外套膜中表达量最高,在性腺中的表达量最低。  4、采用RT-PCR研究华贵栉孔扇贝胚胎发育过程中Δ5 FAD基因表达量的变化。结果显示Δ5 FAD在华贵栉孔扇贝的整个胚胎发育过程中都有表达,在卵中的表达量最高,从原肠胚时期开始减少,到3月大的稚贝期又开始增加。  本文首次从两种海洋双壳贝类中获得PUFA合成途径关键基因,同时研究了这些基因的组织表达特性,初步探索了华贵栉孔扇贝Δ5 FAD基因在扇贝早期发育过程中的表达量变化情况。为今后进一步探索这两种贝类PUFA合成途径的调控打下了基础,丰富了软体动物PUFA合成途径关键酶的研究。
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