三角帆蚌是我国最重要的淡水珍珠蚌,具有很高的经济价值。研究表明,三角帆蚌属于雌雄异体,成年雄蚌的产珠性能较好。在高等动物中和性别调控相关基因研究较多,但对于低等动物,特别是淡水珍珠蚌性别决定机制缺乏系统性的研究,给贝类繁殖育种带来一定困难。本实验通过Race法(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆获得了三角帆蚌HcWNT4、HcDax1、HcSox7基因全长,对这3个基因的序列结构、雌雄各组织表达,早期性腺发育表达进行分析,初步探究在性别决定和性别分化上的作用;并通过抑制剂注射,初步探究与WNT信号通路联系。具体研究成果如下:1.3个基因cDNA全长序列分析HcWNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’非编码区为396 bp、3’非编码区为24 bp,开放阅读框(ORF)为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对HcWNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。HcDax1基因cDNA序列全长为2719bp,其中5’-UTR为188 bp、3’-UTR为1295bp,ORF区为1236 bp编码411个氨基酸。预测其蛋白分子质量为46.22KDa,理论等电点为5.96,为亲水性蛋白,具有一个保守的NR superfamily结构域,并且含有核受体超家族的结构特征DBD和LBD。HcSox7基因序列全长为2315 bp,其中HcSox7基因的开放阅读框(ORF)为1668 bp,共编码氨基酸555个,5’非编码区30 bp,3’非编码区617 bp。对HcSox7氨基酸序列分析,与其他物种相似性较低,预测其蛋白分子量为62.00KDa,理论等电点为7.37,氨基酸残基为亲水性。2.3个基因时空表达特征分析HcWNT4、HcDax1、HcSox7基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程。其中HcWNT4基因在鳃、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。在1至3月表达量较高,推测HcWNT4参与了早期发育和性别分化过程。HcDax1基因在性腺中表达量差异最大,雌性性腺、斧足的相对表达量极显著高于雄性,4月龄表达量显著升高,推测HcDax1基因在雌性中起主导作用。HcSox7基因在肝脏、鳃中表达量较高,在性腺、斧足中的雌性的表达量极显著高于雄性,8月龄表达量最高,4月次之。原位杂交结果显示,HcWNT4、HcDax1、HcSox7基因均在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有蓝色的杂交信号,在精巢中信号不明显,推测可能参与性腺发育过程。3.IWR-1-endo抑制Wnt信号通路目前Wnt信号通路对高等脊椎动物的性别决定和性别分化作用较多,本实验选取6月龄的三角帆蚌作为实验样本,分别注射不同浓度的IWR-1-endo抑制剂,发现HcWNT4、HcSox7和WNT信号通路关键基因β-catenin不同程度下调,推测在三角帆蚌中可能存在Wnt信号通路,抑制该信号通路对性别关键基因有一定影响。4.WNT信号通路关键基因β-catenin免疫应答反应β-catenin是经典Wnt信号通路的重要转录因子,在雌性性腺发育、免疫调节中起着关键作用。本实验注射嗜水气单胞菌和脂多糖后,发现在血细胞和鳃中Hc-β-catenin基因表达量升高,证实Hc-β-catenin基因能帮助机体抵御嗜水气单胞菌和LPS的感染,在免疫应答中起重要作用。