背景:间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)具有较强自我更新能力和多向分化潜能,并且能够在特殊条件诱导下,分化形成包括骨组织、软骨组织和脂肪组织在内的多种类型的组织。目前已经在多种组织和器官中发现了MSC。在组织再生过程中,由于MSC具有较强增殖和分化能力,因此在组织工程领域中,MSC可作为种子细胞参与组织的再生和重建。然而,临床前期的体外研究却发现诸多问题,包括其来源问题、定向分化问题、自身或体外扩增后的衰老问题,这些均有可能影响其在体内的治疗效果,尤其是自身或体外扩增后的衰老,因为在衰老的过程中,MSC的生物学行为都可能出现不同程度的弱化现象,从而影响体内的治疗效果。衰老是指机体的细胞、组织和器官在功能上出现的逐步弱化的生理过程,主要表现为自身抵抗能力的降低以及对外界环境刺激反应能力的降低,从而诱发疾病的易感性并最终引起死亡。在机体衰老的过程中,由于受到病理、环境等因素的刺激,MSC的自我调节机制发生异常改变,从而使其某些生物学性状不再稳定。衰老是机体的细胞、组织和器官在功能上出现的逐步弱化的生理过程,主要表现为自身抵抗能力的降低以及对外界环境刺激反应能力的降低,从而诱发疾病的易感性并最终引起死亡。衰老是一种复杂的生命过程,是多种因素参与并发挥作用的,如信号通路中某个因子的基因突变、环境因素的改变、染色体和转录调节因子的异常调节作用。在这一过程中,多种因素的刺激作用往往能够引起染色体异常调节。研究表明:与其他的单纯性因素相比较,这种染色体异常调节所引起的基因表达异常在体内的持续状态更加持久,并且可以稳定遗传。因此,表观遗传学应运而生。表观遗传学(epigenetic)是与遗传学(genetic)相对应的概念。遗传学是研究基于碱基对序列改变而引起的个体之间基因表达水平差异;而表观遗传学则是研究基于基因状态改变而引起的基因表达水平差异。比较通俗的讲,表观遗传学研究的是则是指:DNA碱基对序列在未发生改变的情况下,基因开放状态发生异常改变、并且这种异常状态可以稳定遗传,也包括生物生命活动中多种程序性的研究。因此,从这个意义上看,表观遗传学在生物体应激、发育、衰老、生病等生命过程中都发挥了重要作用。众所周知,牙周炎是危害人类口腔健康的重要疾病,是导致成年人牙齿缺失的首要原因,传统的牙周治疗能够有效控制/延缓疾病的进一步发展,但都不能真正地实现结构和功能的完全再生。随着组织工程技术和再生医学的发展,利用干细胞促进组织再生成为研究热点。研究表明,利用牙周膜干细胞可以有效促进牙周组织再生,其中2010年发表在Oral Diseases上的世界首篇利用自体牙周膜来源的细胞治疗牙周炎的临床报道,该结果将牙周细胞治疗的研究和临床应用推进到一个从所未有的高度。值得注意的是,临床上牙周炎患者大多为中老年人,而有研究报道,牙周膜干细胞会因年龄因素影响其生物学性能。有研究表明机体在衰老的过程中,由于受到病理、环境等因素的刺激,间充质干细胞(Mesenchymal stem cels,MSC)的自我调节机制会发生异常改变,从而使其某些生物学性状不再稳定。因此,进一步探索机体在随着年龄增长而衰老的过程中,表观遗传学是否参与了牙周炎的发展,是否影响了牙周膜干细胞的生物学性能的改变,有利于加速牙周膜干细胞的临床转化。目的:通过筛选机体在衰老过程中,人牙周膜干细胞(human Periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)发生高通量变化的表观遗传学酶,并探索这些表观遗传学酶如何影响h PDLSCs的生物学性能,从而明确年龄因素影响h PDLSCs的生物学性能的可能机制,为将来临床应用牙周膜干细胞提供依据。方法:1、实验分组:将临床上获得的离体第三磨牙按18-35岁、36岁-55岁和56岁-62岁三个年龄阶段划分为三个实验组。2、h PDLSCs分离、培养和鉴定:利用改良组织块法分离、培养原代h PDLSCs;通过有限稀释法纯化h PDLSCs。流式细胞术检测相关干细胞表面标记物;噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法、成纤维细胞集落形成单位(Colony forming unit-firbroblast,CFU-F)检测细胞自我更新能力;条件培养基诱导各实验组h PDLSCs的成骨、成脂分化,并比较分化能力的差异。3、h PDLSCs衰老过程中的表观遗传酶的筛选:利用RT-PCR技术筛查在各样本中各实验组表观遗传学酶的表达差异;并利用Western-blot进一步验证RT-PCR结果;Western-blot检测比较各实验组h PDLSCs中组蛋白H3乙酰化水平差异。4、Gcn5、p300对h PDLSCs成骨能力的影响:通过筛选结果确定目标蛋白为Gcn5、p300;利用si RN A干扰h PDLSCs组蛋白乙酰化转移酶Gcn5、p300的表达水平后,诱导h PDLSCs骨向分化;分别在长时间点(4周)和短时间点(7天),利用RT-PCR和western blot技术分析比较h PDLSCs在si RNA干扰前(对照组)和si RNA干扰后(实验组)成骨相关基因ALP、RUNX2、OCN表达水平;同时在成骨四周后茜素红染色定量分析实验组和对照组成骨能力差异。5、Gcn5、p300对h PDLSCs增殖能力的影响:利用si RNA干扰年轻h PDLSCs组蛋白乙酰化转移酶Gcn5、p300的表达水平后,MTT检测实验组和对照组细胞的增殖活性,细胞周期分析细胞周期的分布情况;组蛋白乙酰化转移酶p300特异性激活剂CTPB处理衰老细胞后,利用相同的方法分析实验组与对照组细胞的增殖能力的差异。6、统计学分析:所有数据使用SPSS17.0软件统计分析处理,计量资料以均数±标准差(M±SD)形式表示,多个样本均数比较用方差分析,两两比较采用t检验,检验水准p值取双侧0.05。结果:1、本实验利用改良组织块法可成功获得不同年龄阶段h PDLSCs,镜下观察年轻组细胞体积小呈梭形,而随年龄的增长细胞体积增大,各实验组均具有自我增殖能力和细胞克隆能力,但细胞的增殖能力明显随年龄的增加而减弱(p<0.05)。流式细胞检测显示:各实验组细胞均能阳性表达间充质来源干细胞表面标记CD29、CD90和CD146;阴性表达造血干细胞标记CD34和内皮细胞表面标记CD31。骨向分化与脂向分化的结果显示:h PDLSCs在衰老过程中其成骨能力明显减弱(p<0.05);而其成脂能力与年龄因素不存在明确关系(p>0.05)。β-半乳糖苷酶染色实验发现:h PDLSCs在衰老组有较高的β-半乳糖苷酶染色阳性率(p<0.05)。2、本实验主要筛查参与组蛋白修饰的各个家族的表观遗传学酶,筛查对象包括:组蛋白乙酰化转移酶、组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基化转移酶、组蛋白去甲基化酶。在多个修饰家族中,组蛋白乙酰化转移酶家族在衰老的过程中表现出稳定的下调趋势;其中,组蛋白乙酰化转移酶家族的Gcn5和p300在各样本中都发生高通量变化,且各实验组之间存在明显的统计学差异(p<0.05)。同时,Western-blot结果显示:组蛋白H3乙酰化水平呈现下降趋势。3、转染si RNA干扰Gcn5、p300的表达后能够明显的抑制目的基因的表达水平。诱导转染后的h PDLSCs成骨,比较成骨早期和晚期的相关成骨基因检测发现:Gcn5、p300的表达水平明显受到抑制,但RT-PCR和western检测实验组和对照组成骨相关基因表达水平并没有统计学差异(p>0.05)。4、转染si RNA干扰Gcn5、p300表达后分析实验组与对照组细胞周期与MTT结果发现:h PDLSCs的增殖能力减弱;相反的,用250μM的组蛋白乙酰化转移酶p300激活剂CTPB处理衰老细胞后,细胞的增殖能力增强。结论1、h PDLSCs的增殖能力和骨向分化能力随年龄增加呈现下降趋势,而脂向分化能力无明显变化;β-gal活性随年龄增加而增加。2、在衰老的过程中,组蛋白乙酰化水平呈下降的趋势,并且相应参与此过程的酶的表达水平也随之下降,其中组蛋白乙酰化转移酶Gcn5、p300呈现高通量表达。3、组蛋白乙酰化转移酶Gcn5和p300对h PDLSCs的骨向分化能力无明显影响。4、组蛋白乙酰化转移酶Gcn5和p300对h PDLSCs的增殖能力有明显影响,其表达越高,细胞增殖能力越强,表达越低,增殖能力减弱。