论文部分内容阅读
乳腺癌的治疗是癌症治疗中最有难度的一种。术后的化学疗法和放射疗法一直是应用最广泛的传统疗法,但是由于传统化学疗法和放射疗法的局限性,其对人体有着严重的副作用不利于病人的恢复,并且造成了部分乳腺癌的多耐药性,这使得一些病例治疗失败。14-3-3τ在乳腺癌的发生和转移中起着至关重要的作用,可以用作新的药物靶蛋白。二咖啡酰奎宁酸(Dicaffeoylquinic acid,DCQAs)是天然产物,具有抗氧化剂,抗微生物剂和抗炎活性。一些研究表明,某些二咖啡酰奎宁酸对胃癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌等多种类型肿瘤具有很好的抑制作用。二咖啡酰奎宁酸的药效学作用的开发和探索将成为新药开发中的另一个热点。在本研究中,我们研究了DCQA对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞系的抗癌作用以及对三阴性乳腺癌细胞(Triple negative breast cancer,TNBC)的作用机理。首先,我们利用生物学方法和表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)分析筛选了可以与14-3-3τ结合并且对乳腺癌细胞具有明显抑制作用的1,3-DCQA和1,5-DCQA。接着利用MTT法,软琼脂克隆形成实验,Transwell细胞迁移和流式细胞仪分析比较,发现1,3-DCQA和1,5-DCQA均能够显著地降低乳腺癌细胞系的克隆形成、转移和增殖能力,并可以诱导乳腺癌细胞进入凋亡;同时我们也从两者中选出了对乳腺癌细胞转移增殖抑制效果最好的1,3-DCQA。通过对乳腺癌细胞中14-3-3τ的表达和敲低实验分析,我们确认14-3-3τ是1,3-DCQA靶蛋白之一。通过对96μM处理48 h的MDA-MB-231细胞转录组测序分析,我们确定1,3-DCQA通过与14-3-3τ结合,主要通过PI3K-Akt、Jak-STAT和cAMP三条通路对MDA-MB-231细胞造成影响。接着我们找出三条通路中重叠的16个基因:Creb5,Csf3,Crebbp,Ep300,Ifnar2,Il2rb,Il3ra,Il6,Osmr,Pik3cg,Pik3r1,Prlr,Jak2,Bad,Sos1,Sos2并进行了qRT-PCR验证,结果表明1,3-DCQA通过与14-3-3τ结合对这15个基因进行不同情况的调节,其中Il2rb,Bad,Pik3cg被显著上调,Sos1,Sos2,Ifnar2,Csf3,Osmr,Jak2,Il6,Creb5,Pik3r1,Ep300,Prlr,Crebbp被显著下调,进而影响乳腺癌细胞的生物学功能。此外我们还对15个靶基因96μM处理9 h和24 h的转录水平进行验证,获得了一个动态变化过程,即Bad从9 h至48 h均被显著上调,Il2rb在24 h后开始被上调,Pik3cg在48 h被上调,另外Crebbp仅仅在9 h被上调,以后均被下调,而其余11个基因均从9 h后被显著下调。流式细胞结果与死亡标记物Western Blot分析结果表明1,3-DCQA诱导乳腺癌细胞凋亡并且随着化合物浓度的提高会出现细胞焦亡的现象。14-3-3蛋白家族七个亚型的Western Blot分析结果表明1,3-DCQA除了对14-3-3τ有影响外对其余亚型也起到了不同程度的调节作用。肿瘤标记物Western Blot分析结果表明1,3-DCQA通过14-3-3τ显著下调了关键分子的磷酸化水平,降低了乳腺癌细胞的代谢水平。通过对转录组学测序结果的分析验证,我们得到1,3-DCQA抑制乳腺癌细胞增值与转移的分子机理如下:1,3-DCQA与14-3-3τ结合,下调乳腺癌细胞的JAK、AKT、Raf-1、mTOR等蛋白,抑制了乳腺癌细胞的蛋白合成和细胞增殖;上调BAD分子诱导了乳腺癌细胞基于Caspase途径的细胞凋亡。本研究前期利用多种方法综合评估五种二咖啡酰奎宁酸对不同细胞系的生物学影响效果,筛选出了效果最好的1,3-DCQA,并就1,3-DCQA对乳腺癌细胞影响的分子作用机理进行了深入的探究,从多重效果、多项方面、多个环节综合地探究和评估了二咖啡酰奎宁酸的抗乳腺癌的分子作用机制和临床应用前景。提示1,3-DCQA可以作为抗乳腺癌细胞增殖和转移的先导化合物,为开发新的TNBC靶向药物提供理论基础。