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抗菌肽是许多生物特别是昆虫的重要的抗菌因子,也是其非特异性免疫系统的重要组成部分。杂合抗菌肽是利用基因工程手段或者化学人工合成方法,将两种或两种以上抗菌肽的一部分肽链按照一定的设计原则进行连接的新型抗菌肽。一般具有广谱、高效、无毒副作用、溶血性降低、稳定性和活性更强的特点。本试验采用基因工程生物技术手段,用柔性链(ser-ser-gly-ser-gly-ser)将牛乳铁蛋白肽Lfcin B和抗菌肽Tenecin 1的功能区进行连接,根据牛乳铁蛋白肽Lfcin B和抗菌肽Tenecin 1的构效关系、选择的表达载体、选用的工程菌和毕赤酵母偏爱密码子,获得杂合抗菌肽Lf-Te基因序列,利用Primer 5.0设计引物,选用PCR扩增技术将其基因扩增。将Lf-Te基因克隆至质粒pPICZαA中,构建出重组表达载体pPICZαA-Lf-Te,重组质粒经质粒大小、双酶切、PCR扩增鉴定及测序鉴定,证明目的基因已克隆到表达载体上,成功完成了真核表达载体pPICZαA-Lf-Te的构建。将构建成功的重组质粒用内切酶Sac I线性化,电转整合至毕赤酵母GS115宿主菌株中,用含有Zeocin(博来霉素)的选择培养基筛选出阳性克隆转化子。用试剂盒法提取出其基因组后,用PCR扩增法验证重组质粒pPICZαA-Lf-Te已成功整合到酵母基因组中,将其在BMMY培养基中进行甲醇诱导表达,表达产物用Tricine-SDS-PAGE电泳进行检测,结果显示,表达产物约在7.9KD处有清晰的单一条带,与预期的表达产物大小相符合。确定杂合抗菌肽Lf-Te的表达最优条件:为A2B2C2,即诱导时间96h、诱导温度30℃、培养基的初始pH值为5。在此最优条件下诱导,杂合抗菌肽Lf-Te表达蛋白的浓度为1.21mg/mL。本试验采用琼脂穴扩散法检测杂合抗菌肽Lf-Te的表达产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌及啤酒酵母的抑菌效果。结果表明,杂合抗菌肽Lf-Te对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌均有抑菌效果,最低抑菌浓度分别为:0.120mg/mL、0.160mg/mL、0.200mg/mL,对啤酒酵母无抑菌效果。杂合抗菌肽Lf-Te的耐热性较好,在煮沸后的60min内仍有活性,在pH 2-6时,pH越大,抗菌活性越好,pH>6后,抗菌活性逐渐减弱。杂合抗菌肽Lf-Te的活性受紫外照射的影响,紫外照射时间越长,抗菌肽的活性越低。遗传稳定性较好,在经过20次的传代培养后,进行PCR扩增验证,目的基因未发生丢失,表达产物仍具有抑菌活性。综上所述,本研究成功地克隆了杂合抗菌肽Lf-Te基因,构建了真核表达载体pPICZαA-Lf-Te,并完成其在毕赤酵母中的分泌表达。试验结果表明,表达产物仍有良好的生物活性,杂合抗菌肽Lf-Te的抑菌效果良好,为抗菌肽的进一步和应用奠定基础。