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肝素是重要的抗凝和抗栓药物,但大量使用会引起出血和诱导血小板减少等副作用,大大限制其在临床上应用。低分子量肝素(LMWH)是肝素理想替代品,其酶法制备工艺是一个理想的清洁酶工程技术应用体系,但由于肝素酶生产效率低、具有酶分离纯化困难,成本昂贵,检测繁琐,难以实现定向固定化等问题,限制了酶法制备LMWH技术的发展。本论文以肝素酶法制备LMWH为研究对象,通过融合蛋白技术,利用麦芽糖结合蛋白(MBP)与麦芽糖的特异亲和性、荧光蛋白(绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP)的快速定量易检性,构建多功能化肝素酶I(HepA)以实现肝素酶I的生产、检测、纯化、固定化、应用及分离等化工过程的集成,降低酶的成本,建立LMWH的酶法生产工艺。构建了不同连接肽长度的GFP或RFP融合HepA双重融合蛋白体系,结果表明使用荧光蛋白能够快速定量追踪HepA酶活。RFP融合荧光强度比GFP弱,菌体散射造成的荧光损耗和背景干扰较小;但是,RFP-HepA融合蛋白热稳定性不如GFP融合蛋白,这可能与RFP倾向于寡聚化有关。构建了不同连接肽刚柔度的GFP-MBP-HepA及MBP-GFP-HepA融合顺序的三重融合蛋白体系。前者具有较高的HepA比酶活,但MBP几乎失去了对麦芽糖的特异亲和性,且在HepA内部发生了断裂。而在MBP-GFP-HepA融合策略中,目的融合蛋白在胞内表达稳定性高,具有较高的比荧光强度,且维持了MBP的特异亲和性,同时热稳定性也显著提高,30℃下半衰期最大提高至216 min,是MBP-HepA的21.6倍。对连接肽的影响分析结果表明,短连接肽有利于改善HepA对底物肝素的亲和力,提高HepA催化效率;而柔性连接肽能够增加HepA的催化效率、热稳定性及与MBP的亲和力。根据以上研究结果,利用MBP-HepA融合蛋白成功实现了LMWH的制备,研究了工艺条件和收率的影响因素,揭示了235nm吸光度检测在产品质量控制中的有效性,并做了相关成本核算。