论文部分内容阅读
肌肉抑制素基因（MSTN）是脊椎动物中典型的骨骼肌生长发育负向调控因子,其有关核苷酸突变会产生具有较高生产应用价值的“双肌”动物。因而,该基因自发现以来一直都是肉用动物遗传育种研究中的明星基因。中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国具有较高经济价值的甲壳动物,其蜕壳和生长受到了广泛而深入的研究。本实验室的前期研究发现,中华绒螯蟹MSTN基因（Es-MSTN）的一个同义突变位点的等位型与生长性状存在相关性,这引起了我们的兴趣和疑惑:Es-MSTN的同义突变位点是否与生长性状具有相关性?有无生产应用价值和育种潜力?同义突变位点是否存在转录和翻译水平的活性差异?这些都需要实验来验证。因此,本论文针对上述问题开展了较为深入和系统的研究,具体成果如下:1.中华绒螯蟹Es-MSTN基因的结构解析与SNP标记挖掘本章节通过基因分子克隆、序列同源比对等技术手段对中华绒螯蟹Es-MSTN基因的DNA序列进行克隆和分析,发现Es-MSTN基因结构与脊椎动物一样,均包括三个外显子和两个内含子,但存在长度为10224bp和10220bp的两条基因组序列（第一外显子第598位碱基后存在24bp的插入/缺失）,分别编码476和468个氨基酸,两等位型群体间的体重没有显著差异（P>0.05）。同时在原有的三个SNP位点附近又发现了两个新的同义SNP位点（C712T和C717T）。综上结果表明,MSTN基因在中华绒螯蟹和高等动物等物种间,基因组结构和功能域具有较高保守性,中华绒螯蟹的Es-MSTN具有较为丰富的SNP位点变异,可为后续基因功能研究和分子标记辅助育种研究提供参考。2.中华绒螯蟹Es-MSTN基因SNP位点与生长表型的关联分析与验证本章节应用大样本数据（2873只性成熟样本）分析和验证了先前发现的与表型（体重）显著关联的SNP2（C714T）位点,结果表明该SNP位点的三个基因型TT、TC、CC在2873个大样本中的分布频率分别为56.84%、37.52%和5.64%,相应的平均体重分别为212.23±74.11g、214.94±75.14g和208.46±79.72g,三种基因型的体重间不存在显著差异（P>0.05）。同时,应用TC基因型亲本构建自交家系,对产生的TT、TC、CC三种基因型子一代进行饲养试验,发现幼蟹三次蜕壳周期试验后的蜕壳增重率和蜕壳周期在三种基因型间也不存在显著差异（P>0.05）。最后,通过对发现的全部5个SNP位点的73个基因型组合的生长表型进行方差分析,发现CC/TT/AA/TT和CC/TT/AA/TG基因型组合互为单位点等位型,在群体中的比例最高,它们在雌性个体的生长表型无显著差异（P>0.05）,而在雄性个体中CC/TT/AA/TT基因型组合的体重显著高于CC/TT/AA/TG基因型组合（P<0.05）,CC/TT/AA/TT基因型组合受到正选择作用,而CC/TT/AA/TG基因型受到负选择作用（P<0.05）。本研究结果表明,CC/TT/AA/TT和CC/TT/AA/TG基因型组合可以作为中华绒螯蟹的分子标记进行辅助育种,具有一定的育种潜力。3.中华绒螯蟹Es-MSTN基因同义突变对基因转录和翻译的影响研究同义突变可以在基因的转录、翻译、转录后等多个基因功能进程中产生影响。本章节应用定点突变、体外转录和过表达对中华绒螯蟹EsMSTN基因的五个SNP位点T/C（C712T）、T/C（C714T）、T/C（C717T）、A/G（A729G）、T/G（T753G）)对应的14种基因型组合（GC、AT、1T、2T、3T、4A、5T、1C、2C、3C、4G、5G、GG、TT）进行转录和翻译水平的研究。结果发现:14种基因型在体外转录中存在转录效率差异,1C基因型的转录水平最高,而GC和AT基因型的转录水平最低,差异显著（P<0.05）,且AT基因型比GC基因型表现出更高的转录水平（P<0.05）;表型关联的GG基因型的转录强度略高于TT,但两者之间差异不显著（P>0.05）。对上述基因型在293T细胞中进行过表达研究发现:不同突变基因型在转染后的不同时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h）的表达强度存在显著差异（P<0.05）,且AT突变基因型的表达强度显著高于GC突变基因型（P<0.05）;而表型关联突变型（GG、TT）的表达强度之间并未检测到显著差异（P>0.05）。综合研究表明:5个同义突变位点对中华绒螯蟹EsMSTN基因的转录和翻译具有重要影响,同义突变也可能具有较为重要的生物学意义,然而互为单位点等位型的表型关联突变（GG和TT）型在基因编码区的分子功能上并未检测到显著差异（P>0.05）,说明其对表型的影响可能通过其它和该位点连锁的调控区域或基因产生效应。4.中华绒螯蟹Es-MSTN基因的分子功能研究为了解Es-MSTN基因在中华绒螯蟹生长发育过程中的分子功能,本章节使用RNAi手段对幼蟹养殖阶段的中华绒螯蟹MSTN基因进行了为期49天的连续敲降,并评估了实验周期中实验个体的蜕壳和生长特性,检测了脂肪代谢和免疫相关基因的表达差异,分析了实验样本的肌肉和肝胰腺组织的氨基酸和脂肪酸成分差异。研究结果发现:EsMSTN基因的敲降没有对实验蟹的最终体重（第二次蜕壳后的体重）以及蜕壳增重产生影响,但实验组表现出更高的特定生长率（P>0.05）,显著缩短的蜕壳周期（P<0.05）、更低的肝胰腺指数和更高的成活率。进一步对脂肪分解相关基因（胰脂酶（LP）,肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT1β）,脂肪酸结合蛋白（FABP3、FABP9））和免疫相关基因（酚氧化物酶原（PHE）,抗脂多糖因子（ALF）,凝集素H（Lec H）,酚氧化物酶原激活因子（PPAF））在肌肉和肝胰腺组织中的表达情况进行检测,发现:实验组肝胰腺中脂肪代谢相关基因除FABP9外均低表达,而肌肉中均高表达;免疫相关基因在两种组织中均高表达（P<0.01）。最后分析了干扰之后的氨基酸和脂肪酸组成差异发现:Es-MSTN基因的长期敲降使得中华绒螯蟹对脂肪酸的利用产生了显著分化（P<0.05）。本章节的研究说明:中华绒螯蟹Es-MSTN基因是一个重要的生长抑制因子外,还参与到机体的脂肪代谢和免疫功能调节种,表现了该基因的功能多样性。