糖基化是一种复杂的翻译后修饰,对多种细胞生理活动至关重要。蛋白质和脂类上的糖基化由分布于特定高尔基体区室的糖基转移酶或糖苷酶催化。与高尔基体相关的囊泡运输则是维持这些酶正确定位的基础。因此,研究高尔基体网络内外的蛋白质运输机制具有重要的学术意义。本论文分别在芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和人胚肾293(Human Embryonic Kidney 293,HEK293)细胞内以保守的Dop1-Neo1-Mon2复合物为研究对象。运用分子细胞生物学技术,分析了蛋白质的亚细胞定位。我们阐明了Dop1-Neo1-Mon2复合物在芽殖酵母和哺乳动物细胞内后期膜运输是必不可少的。主要结论如下:1.通过对酵母基因组数据库的生物信息学分析,筛选出定位于高尔基体和内涵体的必需蛋白。在这些候选蛋白中,本研究关注Dop1,其作为功能未知的必需蛋白。Dop1与P4-ATPase Neo1相互作用,后者在磷脂转运中发挥作用。荧光显微镜分析表明,Dop1主要定位于早期的反式高尔基体网络(trans-Golgi network,TGN),Neo1主要定位于晚期TGN。2.Dop1或Neo1的缺失导致蔗糖酶的N-糖基化和Gas1的O-糖基化发生严重缺陷。在Dop1缺失细胞中从TGN的逆向运输受到阻碍。高尔基体糖基转移酶Och1在Dop1缺失后的定位由cis-Golgi转变为TGN。这些结果暗示在糖基转移酶从TGN向高尔基体逆向运输过程中Dop1是必不可少的。3.Dop1-Neo1-Mon2复合物在真核生物中是保守的。为深入理解该复合物在细胞后期的膜运输中发挥的囊泡运输功能,我们分析了哺乳动物细胞中Dop1和Mon2的同源物。在HEK293细胞中确认MON2与Dop1的同源蛋白(DOPEY1、DOPEY2)均存在相互作用。通过共聚焦荧光显微镜分析发现MON2主要定位于循环内涵体。MON2-DOPEY复合物具备结合马达蛋白的能力。MON2标记的循环内涵体接近早期内涵体接近、与之相互作用,最后分离。HEK293细胞中MON2基因的敲除导致循环内涵体聚集在早期内涵体周围。4.MON2的敲除减慢转铁蛋白受体从内涵体到细胞膜的循环,也导致细胞质膜内吞的Wntless蛋白不能运输到高尔基体。因为Wntless-EGFP循环途径被阻碍,其被错误的运输到溶酶体。以上结果表明MON2通过调节循环内涵体从早期内涵体的分离来参与转铁蛋白受体和Wntless在内涵体的运输事件。