论文部分内容阅读
大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana),为景天科伽蓝菜属多年生草本植物,叶缘所形成的胎生苗是无性繁殖的方式,是典型的植物体细胞全能性的体现,即叶缘体细胞直接通过分化形成新个体。然而针对这种极为特殊的无性繁殖方式,迄今没有研究阐明胎生苗形成过程所涉及的分子调控网络。在实验室前人构建的落地生根cDNA文库中,发现一个与拟南芥SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)基因同源的EST序列(contig1019)。本研究通过RACE和Genome Walking技术克隆了KdSOC1基因cDNA全长和启动子,进行了相关生物信息学分析,探究了该基因的表达模式并构建了大叶落地生根遗传转化体系及愈伤组织诱导体系,为后期深入研究KdSOC1基因功能奠定了基础。主要结论如下：1通过RACE技术获得KdSOC1基因cDNA全长为1410bp,BLAST比对发现与山核桃SOC1基因同源性相似度达70%,故而命名为KdSOC1基因。其ORF全长为684bp,编码227个氨基酸,CDS具有保守区域MADS-MEF2-like和K-bcx,属于植物MADS Ⅱ型基因。2通过Genome Walking技术获得KdSOC1启动子序列为1401bp,进行顺式作用元件预测发现该基因具有ABRE (ABA作用元件)、CGTCA-motif (MeJA作用元件)、GARE-motif(GA作用元件)、TCA-element (SA作用元件)、rbcS-CMA7a(光响应作用元件)、TATA-box (核心转录起始单元)、CAA-box(转录起始单元)。说明该基因受到多种激素信号的调节,同时参与多个代谢反应。3在启动子顺式作用元件预测基础上,结合实时荧光定量PCR和半定量RT-PCR技术分析了该基因在激素(ABA、SA、GA、MeJA)诱导下及不同环境(自然干旱和长短日照)下的表达模式。激素诱导结果表明,KdSOC1基因对ABA、GA、MeJA和SA激素均有响应,而对SA和GA响应显著且持久。不同光周期诱导结果显示,LD诱导下,植物叶片中KdSOC1基因的表达水平高于SD诱导下的表达量；LD诱导下,KdSOC1基因的表达量急速增加,培养37天时该基因的表达量相对于28天时增加了约10倍,同时伴随胎生苗的快速产生。自然干旱结果显示,随着干旱程度的加深,KdSOC1基因的表达量逐渐增多,轻度干旱时基因的表达水平高于CK1,而中度、重度干旱时基因的表达水平低于CK2-3,此现象与植株产生胎生苗的情况一致。因此,KdSOC1基因能感知和传递环境刺激信号并参与胎生苗的形成。4本研究构建了过表达载体pBIN438-ORF KdSOCI、RNA干扰载体pZH01-AS ORF KdSOC1-GUS-S ORFKdSOC1及启动子载体pBI121-PromoterKedSOC1-GUS载体,并以pBI438载体(NPTⅡ作为筛选标记基因)初步成功构建了落地生根转化体系,为深入研究该基因的功能及其对胎生苗形成的调控机制奠定基础。5为创建胎生苗“体细胞”体外快速研究体系,本研究初步建立高效、高质量落地生根愈伤组织诱导体系,以MS为基本培养基,添加不同浓度6-BA与2,4-D对主茎段、幼嫩及成熟叶片三种外植体进行愈伤组织诱导。研究结果表明,主茎段最佳愈伤诱导激素浓度比例为0.5mg/L 6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈伤发生率为55.56%；幼嫩叶片最佳愈伤诱导激素浓度比例为lmg/L 6-BA:1.5mg/L 2,4-D,胚性愈伤发生率为29.92%；成熟叶片最佳愈伤诱导激素浓度比例为2.5mg/L6-BA:0.5mg/L 2,4-D,胚性愈伤发生率为43.07%。因此主茎段与成熟叶片均为诱导大叶落地生根愈伤组织形成的理想材料。