在胚胎发育和疾病的发生发展过程中,血管内皮细胞可以发生表型的转变,表现为内皮细胞丢失部分自身的特征,同时获得部分其它细胞特有的表型,例如内皮细胞向平滑肌细胞,成纤维细胞等间质细胞转化,称为内皮细胞间质化(endothelial to mesenchymal transition End MT)。在内皮细胞发生间质化转变的过程中,内皮细胞特异性的标记物例如:血小板内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1 PECAM-1/CD31),血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cell cadherin VE-Cadherin)表达减弱,间质细胞的标记物例如:平滑肌细胞肌动蛋白-α(alpha-smooth muscle actinα-SMA),成纤维细胞特异性蛋白(fibroblast-specific protein-1 FSP-1)表达增高。胚胎时期End MT参与组织的生长发育例如:在房室管,心脏瓣膜发育过程中,内皮细胞通过间质化转变形成心脏瓣膜组织。成年后End MT在慢性纤维化过程中发挥着重要的作用,例如心肌纤维化,肾纤维化以及系统性硬化。由内皮细胞间质化转变形成的细胞其生物学特性及功能与正常间质细胞亦有差异。间质化转变而来的细胞分泌细胞外基质功能较强,更容易引起组织纤维化。例如在肺纤维化和肾纤维化过程中间质化转变的内皮细胞分泌细胞外基质以及基质金属蛋白酶的平衡被打破,最终导致组织纤维化。在心血管疾病中,End MT参与了动脉粥样硬化的形成,同时与斑块的不稳定性有关。另外,End MT引起肺动脉管壁重塑导致肺动脉高压。由于End MT是多种疾病的病理基础,寻找引起内皮细胞间质化转变的关键分子对于相关疾病的诊断和治疗具有重要的意义。轴突导向因子家族(Semaphorin)包括一大类分泌性和膜相关性蛋白,最早在免疫细胞中被发现,通过与细胞膜表面受体(plexins以及neuropilins)结合参与神经信号传导。最近发现除了参与神经信号传导,轴突导向因子家族成员还与多种疾病的病理生理改变有关例如:动脉粥样硬化,血管炎症性疾病。Semaphorin7A(Sema7A)与牛痘病毒A39R在序列上有高度同源性,其主要通过与膜受体plexin以及整合素(integrin)结合发挥生物学功能。据报道,Sema7A参与调节嗅觉突触形成,肺纤维化,多发性硬化,T细胞介导的炎症反应以及乳腺癌的发生发展。我们实验室最近报道了Sema7A通过诱导白细胞浸润,单核巨噬细胞粘附,血小板激活以及血管新生而促进动脉粥样硬化斑块的形成。Sema7A可以通过诱导上皮细胞间质化转变促进口腔鳞状细胞癌转移,但是Sema7A在内皮细胞间质化转变中的作用及其机制尚未见报道。本课题提出假说:Sema7A通过TGF/Smad信号通路诱导内皮细胞间质化改变。本研究分为以下五部分:第一部分Semaphorin 7A对内皮细胞功能的影响及在表型转化中的作用目的:探讨Semaphorin 7A在内皮细胞中的功能,以及在细胞表型转化中的作用。方法:我们首先通过慢病毒将Sema7A过表达的质粒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells HUVECs),构建Sema7A-HUVECs细胞系。再通过高通量测序分析Sema7A过表达后,HUVECs基因表达的改变。结合KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG)数据库,分析Sema7A过表达后,哪些信号通路被激活。通过Gene ontology(GO)富集分析,了解Sema7A过表达后内皮细胞的功能改变。利用显微镜观察Sema7A过表达后细胞形态的变化。鉴于CD31是内皮细胞特异性标志物,我们通过流式细胞术检测Sema7A-HUVECs和转染空白载体的对照组Con335-HUVECs细胞膜表面CD31表达的变化。为了进一步验证Sema7A-HUVECs是否发生表型转变,我们通过实时定量聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction q-PCR)和免疫印迹试验(Western-blot)分别在RNA以及蛋白水平对细胞表面标记物进行检测。结果:正常HUVECs中Sema7A几乎不表达,Sema7A过表达质粒转染后Sema7A表达明显增高。与对照组Con335-HUVECs相比,Sema7A过表达引起1168个基因上调,886个基因下调。其中大多数与End MT以及间质细胞相关的基因在Sema7A-HUVECs中表达增高,内皮细胞相关基因表达降低。镜下:对照组Con335-HUVECs细胞呈椭圆形,分布规律,呈铺路石样排列,Sema7A-HUVECs中部分细胞形态变为细长,触角较多,排列紊乱。流式细胞检测发现Sema7A-HUVECs中CD31~+的细胞比例(45.64±2.76%)较Con335-HUVECs(87.48±0.36%)减少约48%。同时q-PCR及Western-blot检测发现Sema7A-HUVECs中CD31,VE-cadherin表达降低,α-SMA,FSP-1表达升高。结论:正常内皮细胞中Sema7A表达量低,Sema7A与内皮细胞的炎症反应,应激刺激,表型转化等改变有关,Sema7A过表达促进内皮细胞间质化转变。第二部分TGF-β2以及TGF/Smad信号通路在Sema7A调节End MT中的机制研究目的:探讨TGF-β2以及TGF/Smad信号通路在Sema7A引起内皮细胞间质化转变中的作用。方法:通过q-PCR检测TGF-β2在Sema7A-HUVECs以及Con335-HUVECs中表达量,利用ELISA检测细胞上清液中TGF-β2浓度。利用基因富集对测序数据进行分析,寻找Sema7A-HUVECs中激活的信号通路。通过检测Smad3蛋白磷酸化水平(pSmad3)来验证TGF/Smad信号通路的变化。最后利用TGF-β2中和抗体T4442以及TGF-β/Smad信号通路阻断剂Oxymatrine,抑制TGF-β2及TGF-β/Smad信号通路在Sema7A-HUVECs中的作用,验证TGF-β2以及TGF-β/Smad信号通路在Sema7A引起内皮细胞间质化过程中的作用。结果:通过q-PCR和ELISA,我们发现了Sema7A过表达后TGF-β2表达增高,与高通量测序结果一致。基因集合富集分析(Gene set enrichment analysis GSEA)显示Sema7A-HUVECs中TGF-β/Smad通路被激活。Smad3磷酸化是TGF-β/Smad信号通路激活的特异性指标,Western-blot结果显示Sema7A过表达后Smad3蛋白发生磷酸化改变,提示TGF-β/Smad通路的活化。相反TGF-β/Smad信号通路阻断剂Oxymatrine以及TGF-β2中和抗体T4442都可以降低Sema7A-HUVECs中Smad3磷酸化水平,提示TGF-β2是Smad3的上游基因。进一步研究发现Oxymatrine以及T4442可以上调Sema7A-HUVECs中CD31表达,降低α-SMA表达,即抑制TGF-β2以及TGF-β/Smad可以减弱Sema7A过表达引起的End MT。结论:TGF-β2以及TGF-β/Smad信号通路在Sema7A引起内皮细胞间质化转变中发挥着关键的作用。第三部分ATF3介导Sema7A以及TGF-β2的机制研究目的:探讨ATF3在Sema7A引起End MT中的作用及分子机制,方法:结合RNA测序数据,我们推测ATF3与Sema7A引起的End MT有关。于是我们分别通过q-PCR,Western-blot在Sema7A-HUVECs中鉴定ATF3表达的变化。通过Chip以及荧光素酶报告基因实验探讨了ATF3与TGF-β2之间的相互作用。最后利用ATF3干扰RNA-ATF3-si RNA,验证ATF3在Sema7A引起End MT中的作用。结果:除了TGF-β2,RNA测序结果显示在Sema7A-HUVECs中ATF3同样明显升高。通过q-PCR以及Western-blot我们验证了Sema7A-HUVECs中ATF3表达的增高。为了探讨ATF3是否能通过TGF-β2调节End MT,我们首先将ATF3-si RNA转入Sema7A-HUVECs,结果显示TGF-β2 RNA以及细胞培养上清液中TGF-β2表达均降低。提示ATF3参与调节TGF-β2的表达。进一步通过Chip-PCR实验利用ATF3抗体沉淀Sema7A-HUVECs DNA片段,结果显示:在ATF3抗体/Sema7A-HUVECs DNA沉淀复合物中可见TGF-β2片段,且与Con335-HUVECs相比,在Sema7AHUVECs中ATF3抗体结合的TGF-β2片段占总体TGF-β2片段的比例增加。荧光素酶报告基因实验显示:转染ATF3过表达质粒促进TGF-β2启动子区的报告基因的荧光强度,而当启动子区域6个碱基突变后,这种改变消失,提示ATF3与TGF-β2的启动子区域相结合,促进其转录。同时我们观察到ATF3过表达并不能上调Sema7AHUVECs中TGF-β1的表达。接着我们探讨了ATF3是否参与Sema7A过表达引起的End MT,通过转染ATF3-si RNA进入Sema7A-HUVECs,我们发现Smad3磷酸化水平降低,提示TGF-β/Smad信号通路被抑制。同样抑制ATF3后CD31表达上调,α-SMA表达下调,提示抑制ATF3后Sema7A过表达引起的End MT减弱。结论:Sema7A过表达上调ATF3,ATF3通过结合在TGF-β2启动子上,促进TGF-β2转录。Sema7A促进ATF3与TGF-β2相结合,最终通过TGF/Smad信号通路诱导End MT。第四部分Integrin-β1在Sema7A诱导End MT中的作用探讨目的:探讨integrin-β1在Sema7A过表达引起End MT中的作用。方法:Integrin-β1是Sema7A在内皮细胞上的受体之一。我们实验室之前报道了,Sema7A通过结合integrin-β1调节内皮细胞功能。我们利用integrin-β1的中和抗体P5D2阻断integrin-β1在Sema7A-HUVECs中的作用后,检测ATF3,TGF-β2以及End MT改变。进一步,我们设计了rescue实验来验证ATF3介导Sema7A/integrin-β1与TGF-β2/Smad之间的信号传导以及End MT。我们通过转染ATF3过表达的质粒进入提前孵育P5D2的Sema7A-HUVECs,来观察内皮细胞表型改变。结果:阻断integrin-β1后,Sema7A-HUVECs中ATF3,TGF-β2以及Smad3磷酸化水平降低。同时CD31表达升高,α-SMA表达降低提示间质化转变减弱。另一方面,ATF3过表达可以逆转由于integrin-β1阻断所引起的TGF-β2以及End MT的减弱,表现为CD31降低,α-SMA表达增高。结论:Sema7A通过integrin-β1-ATF3-TGF-β2引起内皮细胞间质化转变。第五部分Sema7A在扰动流引起的内皮细胞间质化中的作用目的:前期实验发现,颈部动脉部分结扎(partial carotid artery ligation PCL)引起的扰动流(disturb flow d-flow)可以上调内皮细胞Sema7A表达,我们利用Sema7A基因敲除的小鼠,以及PCL模型在体内研究Sema7A在End MT中的作用。方法:首先通过颈动脉部分结扎建立颈部血管扰动流的模型,再利用免疫荧光染色在Sema7A+/+以及Sema7A-/-小鼠颈动脉内膜中检测内皮细胞特异性标记物以及间质细胞特异性标记物的表达。结果:在野生型小鼠PCL模型的颈动脉内膜中,可见CD31/α-SMA,CD31/FSP-1以及VWF/α-SMA共表达的细胞,且CD31,VWF信号连续性中断,表达减弱,提示扰动流诱导血管内膜End MT。而在Sema7A敲除的小鼠中这种共表达的细胞几乎见不到,且相对于野生型小鼠,Sema7A-/-小鼠扰动流处血管内膜CD31表达增高。结论:PCL诱导的扰动流促进血管内皮细胞发生间质化改变,Sema7A参与扰动流引起的End MT。