论文部分内容阅读
李斯特菌病是一种由单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）引起,可以感染家畜、家禽以及人类的人畜共患食源性疾病。在人类患者中,李斯特菌病的特征是发热性胃肠炎,脑膜脑炎,流产和败血症,病死率为30%。在LM感染易感宿主的过程中,依赖于各种毒力因子的共同作用。早期的研究发现,LM的特征性溶血表型可归因于李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O,LLO）的活性,LLO由hly基因编码,hly基因位于李斯特菌毒力岛I（LIPI-1）上。在谱系I型菌株中还具有额外的一个毒力岛,称为LIPI-3,毒力岛3上的lls基因簇编码第二种溶血素,命名为李斯特菌溶血素S（Listeriolysin S;LLS）。LLS是一种可以调节宿主肠道微生物群且可使细胞发生溶血的细菌素,在单增李斯特菌侵袭细胞穿越血肠屏障的过程中扮演着极其重要的角色。llsB基因在LLS操纵子中编码特定的翻译后修饰酶,是LM在小鼠内脏器官定植所必需的,llsB基因的失活足以减少肝脏和脾脏中LM的数量,表明llsB基因编码的产物对LM的生物活性有着重要的作用。目的:本研究以4b型新疆致绵羊脑炎临床分离株LM90为实验对象,首先确定LM90是否有毒力因子LLS,并研究LLS在致绵羊李斯特菌病的过程中的部分生物学特性。为进一步探究LLS的致病机理及研究LM穿越机体屏障结构的作用机制提供一定的研究基础,确定llsB基因缺失株是否可以作为李斯特菌减毒苗的备选菌株。方法:1、LM90 llsB基因的克隆及其缺失株的构建PCR扩增LM90 llsB基因并测序,为研究LM的llsB基因功能及作用机制奠定基础。分别PCR扩增llsB基因上、下游同源臂,利用Overlap PCR技术连接上、下游同源臂,以获得缺失llsB基因的融合片段ΔllsB;将融合片段ΔllsB与pMD19-T质粒连接,构建重组质粒pMD19-T-ΔllsB;将测序结果正确的重组质粒与温敏型载体pKSV7分别进行双酶切,将酶切后的ΔllsB与pKSV7连接,构建pKSV7-ΔllsB重组质粒,将其通过电转至LM90感受态细胞中;利用同源重组技术,在温度和氯霉素抗性的双重压力下进行连续传代培养,传代过程中利用旁外侧引物进行PCR检测并筛选,以获得llsB基因缺失株LM90-ΔllsB;30℃和无氯霉素抗性条件下连续传代培养丢失pKSV7质粒,筛选出无氯霉素抗性的基因缺失株LM90-ΔllsB,旁外侧引物PCR检测无返祖现象。2、llsB毒力基因的缺失对LM部分体外生物学特性的研究通过腹腔注射感染试验小鼠,检测亲本株LM90与缺失株LM90-ΔllsB对试验小鼠的生长曲线,LD50,脑、肝、脾载菌量,溶血活性的影响,分析llsB基因缺失后对LM的生长特性以及毒力的影响;利用溶血试验检测亲本株LM90与缺失株LM90-ΔllsB的溶血效价以判断缺失llsB基因对LM90溶血能力的影响。结果:1、本研究通过PCR扩增获得llsB基因,确定LM90菌株中含有毒力基因llsB。2、成功构建了LM90 llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,且遗传性良好。3、亲本株LM90与缺失株LM90-ΔllsB的LD50仅相差了0.33个对数数量级,说明llsB基因缺失对LM毒力的影响不大;通过腹腔注射感染试验小鼠24 h、48 h、72 h后,亲本株LM90的肝、脾载菌量高于缺失株LM90-ΔllsB,统计学分析表明载菌量差异具有统计学意义（P<0.01）,在小鼠脑中未检出LM。缺失株LM90-ΔllsB较亲本株LM90溶血能力上升了2倍,表明llsB基因缺失对LM90溶血能力具有一定的影响。研究结果表明,llsB基因对LM穿越血肠屏障以及毒力影响上起着一定的调控作用。结论:本研究利用Overlap PCR和同源重组技术,成功构建出了LM90 llsB基因的缺失株LM90-ΔllsB,为进一步研究llsB毒力基因在LM穿越宿主三大屏障的过程中所发挥的作用奠定了一定的研究基础。通过比较亲本株LM90与缺失株LM90-ΔllsB在生长曲线,半数致死量(LD50),肝脏、脾脏、脑组织中的载菌量,溶血试验的结果差异,分析了llsB基因的缺失对LM90部分生物学特性的影响,证实llsB基因对LM90的部分生物学特性有着一定的影响,但从总体分析llsB基因的缺失对LM90部分生物学特性作用不明显,说明llsB基因缺失株不适合作为制备李斯特菌减毒苗的备选菌株。