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目的:缺血性脑卒中是临床常见的具有较高致死率和致残率的疾病。临床研究发现苦碟子对缺血性脑卒中具有较好的治疗效果,但对其作用机制的探查尚不全面。本课题以苦碟子治疗缺血性脑卒中的临床疗效为依据,运用MCAO/R模型和神经细胞系模型,通过整合运用蛋白质组学、高通量测序、生物信息学、分子生物学以及网络药理学等多种系统生物学研究方法,从体内和体外不同维度探查苦碟子治疗缺血性脑卒中的效应及机制。方法:(1)雄性SD大鼠45只,随机分为假手术组15只、造模组30只。造模组采用改良的线栓法复制大鼠MCAO/R模型,成模后将造模组大鼠随机分为模型组15只,苦碟子组15只。苦碟子组给药量依据成人口服苦碟子生药20g计算,在成模后每隔3h给予模型动物4mL/kg苦碟子提取物腹腔注射。假手术组和模型组给予等量的生理盐水腹腔注射。24h后观察各组动物的神经功能评分(mNSS),脑梗死面积(TTC染色),脑组织形态变化(HE染色),神经细胞凋亡情况(TUNEL染色);(2)比较各组动物大脑缺血半影区差异蛋白表达的情况,并用Western-blotting的方法验证;(3)用液质联用的方法鉴定苦碟子所含成份以及入脑成份,并运用网络药理学的方法分析苦碟子入脑成份靶点与差异蛋白靶点的交集,获得苦碟子入脑有效成份。(4)依据蛋白质组学结果,苦碟子的作用主要在于调节神经递质水平,抑制过量的兴奋性神经递质对神经元的损伤。用大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞系模拟神经元进行后续机制的探查,PC12细胞用DMEM F12K完全培养基在37℃,5%CO2的培养箱中培养,用NGF处理7天,刺激PC12细胞轴突生长。在PC12细胞系中使用10mM谷氨酸刺激细胞12h,复制兴奋性神经递质损伤模型,同时给予苦碟子及其入脑有效成份干预3h。对干预后的细胞用CCK-8检测细胞活力;并检测苦碟子及其入脑有效成份对PC12细胞内外谷氨酸水平的影响。(5)用苦碟子及其入脑有效成份干预细胞3h后收集细胞,用RNA-Sequencing的方法对细胞进行转录组测序。分析差异表达基因,并运用生物信息学的方法获得差异表达基因富集的生物过程及信号通路。(6)对体内的差异蛋白核心网络和体外的核心调节差异基因进行荟萃分析,获得苦碟子治疗缺血性脑卒中的核心靶点/通路,并用Western-blotting和RT-qPCR的方法对上述靶点进行验证。通过分析核心通路,获得通路之间的串扰关系,并获得苦碟子及其入脑有效成份通过核心通路调节的转录因子;用JASPAR预测与神经递质转运相关基因启动子区域与上述转录因子的结合位点;用抑制剂干预上述通路,用RT-qPCR验证苦碟子通过上述通路进行转录调控的机制。结果:(1)本研究发现,MCAO/R模型存在着明显的神经功能损伤,经过苦碟子治疗后模型动物的神经功能评分明显降低。TTC染色发现,MCAO/R模型存在着明显的脑梗死灶,苦碟子治疗后模型动物的脑梗死面积明显减小。运用HE染色进行组织学观察发现,MCAO/R模型动物的大脑皮层及纹状体区域存在着明显的组织变性,表现为细胞核皱缩,神经元空泡变性等;经过苦碟子治疗后组织变性明显好转。TUNEL染色发现,模型组动物病灶脑区及其周边的神经细胞凋亡增多;且经过苦碟子治疗后,神经细胞凋亡明显减少。(2)对各组动物缺血半影区以及相应位置进行蛋白组学分析发现,模型组和假手术组之间的差异蛋白主要富集在调节囊泡介导的胞吐作用,血小板聚集,补体激活,凋亡过程的负调控等生物学过程;蛋白所涉及的细胞结构主要包括神经元、突触、囊泡、细胞外泌体等;差异蛋白所涉及到的分子功能主要包括SNARE结合,GTPase活性等。KEGG富集分析发现模型组差异蛋白主要富集在补体和凝血级联,加压素调节水的重吸收,GABA能突触等通路。而苦碟子组和模型组的差异蛋白主要参与止血、突触小泡循环,TP53调节基因,突触小泡运输等通路及生物学过程。对苦碟子组与模型组之间的差异蛋白进行蛋白互作网络(PPI)分析后,获得了一个具有103个节点,353条边的核心网络模块。对模块中的蛋白进行GO分析发现,核心调节模块的蛋白主要涉及调节神经递质水平和囊泡的融合、胞吐和回收等生物过程。KEGG通路富集发现,核心模块蛋白主要参与调节突触小泡循环,SNARE在囊泡运输中的相互作用,谷氨酸能突触和cAMP信号通路等通路或生物学功能。(3)用液质联用的方法在苦碟子中共检测到81种成份,并且其中的9种可以在模型动物大脑中检测到。运用网络药理学方法获得9种入脑成份的靶点并与苦碟子治疗MCAO/R模型的差异蛋白进行交叉分析。在9种入脑成份中,芦丁、阿魏酸和腺苷的靶点与苦碟子体内调控的差异蛋白吻合度最高。所以我们认为,腺苷、阿魏酸和芦丁是苦碟子入脑的有效成份。(4)在用10mM谷氨酸刺激细胞12h的兴奋性神经递质毒性模型中,PC12细胞的活力被明显抑制;用苦碟子及其入脑有效成份干预后,可以明显减轻过量谷氨酸对PC12细胞活力的抑制作用。并且运用苦碟子及其入脑有效成份干预后,PC12细胞外谷氨酸水平均明显降低;苦碟子和腺苷干预后PC12细胞内谷氨酸水平明显降低,芦丁干预后PC12细胞内谷氨酸水平明显升高。(5)比较各实验组差异基因的富集分析结果发现,各实验差异基因所调控的通路既有重叠又有差异。对苦碟子及其入脑有效成份干预后PC12细胞的差异基因进行交集分析,共获得277个核心调节基因,核心调节基因主要参与通过cAMP信号通路,PI3K-Akt信号通路,钙信号通路,轴突导向等多条信号通路。对核心调控差异基因进行IPA分析发现,其主要参与调节的经典通路包括轴突导向,cAMP介导的信号传导、G蛋白偶联受体信号传导、eNOS信号通路等多方面。(6)基因测序和蛋白质组学结果共享的信号通路包括囊泡介导的运输、突触传递、神经递质转运、cAMP信号通路、血液循环、PI3K-Akt信号通路等通路及生物学过程,将上述通路定义为苦碟子的核心调控通路。用RT-qPCR验证苦碟子及其入脑有效成份干预后核心调控通路相关的基因。结果发现Nfatc4,Vamp1,Snap25,Slc6a4明显下调;Slc1a2表达升高明显;Cplx1在苦碟子干预后明显升高,在腺苷、阿魏酸和芦丁干预后降低。另外在苦碟子及其入脑有效成份干预后Crebl,Camk2g,Nr4a1和Bcl2表达升高明显;Th,Nfkb1表达明显降低。用Westrn-blotting的方法验证苦碟子和腺苷干预上述基因的蛋白表达,结果和RNA-Seq测序数据相一致。通过分析发现cAMP通路和PI3K通路存在着串扰,两条通路均参与调控Creb1和Nfkb1,并且cAMP通路还参与调节Nfatc4,上述三者编码重要的转录因子CREB,NF-κB和NFAT家族。用JASPAR预测转录因子的结合位点发现Slc1a2在基因的启动子区域同时存在Creb1和Nfkb1的结合位点;Vamp1和Snap25在基因的启动子区域存在Nfatc4的结合位点。Grin1在基因启动子区域同时存在Nfkb1和Nfatc4的结合位点。用抑制剂同时阻断cAMP通路和PI3K通路后苦碟子及其入脑有效成份对上述转录因子的调控作用消失,并伴随着对神经递质水平调节相关基因的调控作用消失。结论:上述研究表明,苦碟子对缺血再灌注损伤模型(MCAO/R)具有较好的疗效;苦碟子治疗MCAO/R模型的主要环节在于调节MCAO/R模型的神经递质稳态,抑制神经兴奋毒性,其分子机制在于苦碟子及其入脑有效成份可以同时调控cAMP通路和PI3K通路,以调节CREB、NF-κB和NFAT家族转录因子,影响其对下游Vamp1、Snap25、Slc1a2和Grin1基因的转录调节,发挥抑制囊泡的胞吐、增加兴奋性神经递质的转运并抑制其受体后传导的功能。从而抑制神经兴奋毒性,在缺血性脑卒中病理中起到对神经细胞的保护作用。