黄曲霉毒素B1 (AFB1)是一种毒性极强的环境致癌物,以往研究已证实AFB1暴露能导致肝损伤、肝癌等肝脏疾病。职业人群特别是粮食加工场所空气中存在AFB1污染,但其与呼吸系统疾病的关系鲜受关注。AFB1是间接致癌物,需要经过CYP酶的代谢活化,并通过活性中间代谢产物如AFB1-endo-8,9-环氧化物才能发挥其致癌性及强毒性。CYP2A13作为表达在呼吸道内的肝外代谢酶,本课题组以往发现CYP2A13能够代谢活化AFB1并引起支气管上皮细胞损伤和恶性转化,但与呼吸系统损伤的关系尚未证实。小鼠体内的CYP2A5是人类CYP2A13的同源代谢酶,其代谢AFB1的活性与CYP2A13较接近。本研究通过构建cyp2a5敲除小鼠,利用气管滴注AFB1染毒,比较敲除小鼠和野生型小鼠的肺组织损伤效应、炎症反应及其主要类型,试图解析CYP2A5在AFB1所致小鼠肺损伤中的重要作用,为系统探讨CYP2A13对AFB1的代谢活化以及与人群呼吸系统疾病的关系提供实验依据。第一部分：Cyp2a5全身性敲除小鼠的构建及鉴定目的：构建Cyp2a5基因敲除(KO)小鼠,为后续研究提供动物模型。方法：构建Cyp2a5基因打靶载体,通过电转将打靶载体导入C57BL/6小鼠的ES细胞中,药物筛选ES,经PCR及Southern验证Knockout ES细胞；经显微注射注射入囊胚中：将囊胚移植到代孕母鼠体内：生产出嵌合体小鼠后与野生型小鼠杂交获得杂合子F1代Knockout小鼠。F1代小鼠提取鼠尾DNA进行基因型鉴定,鉴定为阳性的互交扩大繁殖生成F2;F2代小鼠提取鼠尾DNA进行基因型鉴定,F2小鼠提取典型脏器的RNA进行RT-PCR验证。结果：嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交产生13只F1代小鼠,经PCR鉴定有4♂和4早为阳性；F1代小鼠互交产生25只F2代小鼠,其中11只鉴定为杂合子,6只为野生型WT,8只为KO纯合子,符合遗传定律,性别分配均衡,未发现有胚胎致死及发育缺陷；F2代小鼠中WT小鼠其肺脏、肝脏、肾脏均有Cyp2a5的表达,而KO小鼠相应脏器未发现Cyp2a5的表达,提示Cyp2a5敲除小鼠构建成功。第二部分：AFB1对Cyp2a5敲除小鼠急性肺损伤的效应评价目的：研究CYP2A5在气管滴注AFB1所致小鼠急性肺损伤中的作用,为阐明CYP2A13在职业场所AFB1空气暴露与呼吸系统疾病关系中的作用提供实验依据。方法：建立经气管滴注AFB1染毒的动物模型,检测WT小鼠和KO小鼠肺脏HE病理损伤程度、肺泡灌洗液(BALF)中乳酸脱氢酶(LDH)活性、总蛋白量、渗出细胞数量,评价两种基因型小鼠的肺脏急性损伤程度;细胞涂片染色分析BALF中炎性细胞类型、免疫荧光分析肺组织中巨噬细胞的分布、芯片分析血清中炎症相关的细胞因子,评价两种基因型小鼠肺脏炎症的发生程度及可能的机制。结果：低剂量(1mg/kg)AFB1暴露1天后,敲除小鼠肺泡灌洗液中LDH活性、蛋白含量、总细胞计数均显著低于野生型小鼠；随着暴露时间的增加,效应指标无显著增加趋势,而且两种基因型小鼠效应指标间无显著差异。高剂量(10mg/kg) AFB1暴露后,随着暴露时间的增加,WT小鼠肺泡灌洗液中LDH活性、蛋白含量、总细胞计数,病理损伤程度均呈显著增加趋势；在1、3、7天时间点敲除小鼠效应指标均显著低于野生型小鼠。高剂量(10mg/kg) AFB1暴露1天后,野生型小鼠血清中的IL-6含量显著高于敲除小鼠；随着暴露时间的增加,巨噬细胞的数量及所占比重呈增加趋势。结论1.我们构建并成功获得了Cyp2a5敲除小鼠的纯合子,该小鼠形状可以遗传后代；是我们探讨主要表达在人体呼吸系统中的CYP2A13代谢酶对外源化学物(比如AFB1)代谢活化的良好模型。2.呼吸道暴露AFB1可以引起急性肺损伤,并且引出炎症反应：而在此过程中,小鼠肺脏内CYP2A5对AFB1的代谢活化起重要作用3.不同剂量的AFB1暴露毒效应不同,10mg/kg的剂量毒效应大于1mg/kg的剂量；相同剂量暴露不同时间时,在10mg/kg的剂量3天、7天组毒效应均大于1天组。4.高剂量AFB1暴露引起急性损伤及炎症反应,IL-6可能参与了初期的炎症反应；巨噬细胞可能介导了随后炎症反应的持续。