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背景和目的：N-(6-Aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide (W-7)是一种众所周知的钙调蛋白(calmodulin)抑制剂,一般被用做研究calmodulin调节细胞内钙信号相关的通路的工具药。本课题旨在利用稳定表达hERG (Kv11.1), hKvl.5和Kir2.1钾通道的HEK293细胞,研究W-7是否对上述电流的直接抑制作用。比较研究了W-7对野生型hERG通道与三种突变型的hERG通道的作用,以明确W-7与hERG通道结合的分子机制。同时也研究了另外一种钙调蛋白抑制剂(W-13)对hERG电流以及hKv1.5和Kir 2.1电流的作用。采用全细胞膜片钳技术记录表达于HEK293细胞的hERG钾电流,hKv1.5和Kir 2.1钾电流。结果：CaM抑制剂W-7可以抑制hERG钾电流,hKv1.5和Kir 2.1电流。W-7浓度依赖性的抑制hERG电流,半数最大效应浓度IC50为3.5μM。W-7对hERG电流的抑制也具有电压依赖性特点,在+10 mV到+60 mV之间抑制作用更加明显。W-7可使hERG电流电压依赖性稳态激活和失活曲线左移,失活速度加快。电极内液给予10μM W-7对hERG电流产生微弱的抑制作用,弱于细胞外液给予W-7对hERG的抑制作用。在不含EGTA的电极内液中渗透给予500nM CaM(以确保细胞内游离Ca2+维持在生理水平)对hERG电流没有明显的作用,而且不影响细胞外液给予W-7对hERG电流的抑制程度。hERG钾通道S6跨膜结构域的氨基酸突变位点Y652A和F656V,以及孔道区域突变位点S631A可改变W-7对hERG通道的敏感性,W-7对3种突变hERG通道的半数抑制浓度(IC50S)分别为5.5μM,9.8μM和25.4μM。此外W-7也可抑制hKv1.5和Kir2.1电流,其IC50分别为6.5μM和13.4μM。另外一种钙调蛋白抑制剂W-13也可抑制hERG电流,hKv1.5和Kir 2.1电流,IC50分别为19.8μM,75.54μM,43.75μM。结论：以上研究结果提示钙调蛋白抑制剂W-7可直接阻断表达于HEK293细胞上的hERG钾电流,hKv1.5和Kir 2.1电流。因此在解释W-7对离子通道的影响时需谨慎。背景和目的：小鼠3T3-L1前脂肪细胞被广泛用作代谢方面的研究,然而,其细胞生理(如功能性离子通道的表达)还未被阐明。本研究主要采用全细胞膜片钳技术,RT-PCR,免疫印迹(western blot),细胞增殖检测方法来探索3T3-L1前脂肪细胞离子通道的表达以及离子通道是否参与细胞增殖调节。结果：我们发现3T3-L1前脂肪细胞表达三种类型的离子通道,39%的细胞可记录到中电导的钙激活的钾电流(Ca2+-activated K+current(IKca)),15%的细胞记录到内向整流钾电流(Kir),在等渗(1T)条件下只有8%的细胞可记录到氯通道电流,而有趣的是,在低渗透压(0.8T)条件下几乎所有的细胞可记录到氯电流,提示该氯通道为容量激活的氯通道。3T3-L1细胞所记录到的IKir电流可被Ba2+阻断；IKc。电流可以被中等电导的钙激活的钾电流阻断剂clotrimazole阻断,提示所记录到钙激活的钾电流为IKC。电流。Icl可以被氯通道阻断剂DIDS阻断。RT-PCR结果表明了3种通道mRNAs的显著表达,KCa3.1基因(IKca),Kir2.1基因(IKir),和Clcn3(ICl.vol)。我们采用免疫印迹的方法可检测到这三种通道蛋白的表达。MTT和3H胸腺嘧啶渗入法检测细胞增殖结果表明,IKCa阻断剂clotrimazole和ICl.vol阻断剂DIDS均可浓度依赖性的抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,clotrimazole(3μM)和DIDS (200μM)对细胞增殖的抑制率分别为(10.55±2.97%和60.98±1.79%,P<0.01 vs control)。使用特异性的RNA干扰(short interference)序列,将KCa3.1或Clcn3基因沉默,KCa3.1或Clcn3 siRNA (100nM)均可显著下调IKC。或Icl.vol的mRNA和蛋白表达,并可抑制细胞增殖,最大抑制率分别为(11.29±2.5%和12.76.29±2.7%, P<0.05 vs control)。流式细胞仪分析细胞周期结果表明,clotrimazole和DIDS均可浓度依赖性的增加G0／G1期细胞比例,clotrimazole (3μM)和DIDS (200μM)可使G0／G1期细胞停滞,分别使G0／G1期细胞比例从对照组的50.93±1.64%增加至55.29±3.13%(P<0.01)和70.21±4.09%(P<0.01),并可降低S期的细胞比例。特异性的KCa3.1和Clcn3 siRNA干扰序列将通道基因沉默后可得到与特异性阻断剂相似的结果,与control siRNA组相比,特异性的KCa3.1 siRNA(100nM)使G0／G1期的细胞比例从44.38±4.5%增加至48.56±4.89%(n=3,P<0.01),而Clcn3 siRNA (100nM)可使从G0／G1期的细胞比例从53.64±0.68%(control siRNA)增加到60.54±0.82%(n=3,P<0.05)结论：这些实验结果首次表明了三种功能性的离子通道包括：中电导的钙激活的钾通道(IKCa),容量敏感的氯通道(Icl.vol)和内向整流钾通道(Kir2.1)共同存在于3T3-L1前脂肪细胞上,其中IKC。和ICl.vol通道可参与调节细胞增殖。