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昆虫病原真菌是一类重要的杀虫微生物,具有主动侵染寄主、寄主不易产生抗性和易形成流行病等特点,在害虫生物防治中具有广阔的应用前景。然而,目前昆虫病原真菌的基础研究相对薄弱,有关昆虫病原真菌发育、侵染、致病等方面的分子机理研究缺乏明晰的认识,限制了真菌杀虫剂的开发和利用。因此,加强对昆虫病原真菌的分子机理研究,从全基因组水平阐明各个关键基因的功能,可以加速对昆虫病原真菌生物学及致病分子机制的认识,进而充分挖掘其在生物防治中的潜力,并最终创造出既适合市场需要又对环境友好的真菌杀虫剂。本论文利用本实验室已经建立的球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体库,筛选与球孢白僵菌发育、抗逆、毒力等相关基因,进而阐明其在球孢白僵菌中的功能。我们筛选得到一株产孢量减少的突变体M936,并利用YADE法克隆到一个与VB1合成相关的噻唑合成酶基因。该基因破坏影响了球孢白僵菌的产孢量和生长形态,但对分生孢子的萌发率与菌株毒力影响不显著。主要研究结果如下:1.突变体的筛选及遗传稳定性分析从球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体库中筛选得到一株只在菌落中央产孢,外围几乎不产孢,菌丝分枝细密,色素颜色深黄的突变体M936。连续传代分析表明,该突变性状能稳定遗传。2.噻唑合成酶基因的克隆与特征分析利用YADE技术在突变体M936的T-DNA插入位点左翼克隆到1.3kb的DNA片段,经在NCBI上blast比对,发现与赤霉菌Gibberella zeae PH-1的VB1合成路径中的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因THI4有较高的同源性（identities=83%）。经连续的YADE克隆,获得该同源基因的完整序列,其编码的氨基酸与噻唑合成酶家族有相同的保守区域,因此将该同源基因命名为BbThi,GenBank登录号为:EF122790。YADE法克隆到的BbThi DNA片段长2370 bp,包含1403 bp的启动子区域和1100 bp的BbThi基因。分析发现启动子区域含6个CAAT启动子元件和3个压力反应元件STREs（stress responsive element）。BbThi包括一个长度为107bp的内含子,ORF（open reading frame）长993 bp,编码一330个的氨基酸的蛋白,推测的蛋白质分子量为35.25kDa,等电点5.89。BbTHI中含有一个噻唑合成酶基因家族共有的ADT（腺苷二磷酸-5-（β-乙基）-4-甲基噻唑-2-羧酸）活性结合位点。Southern杂交结果表明,BbThi在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。3.BbThi的功能分析3.1基因敲除利用基因敲除策略,采用农杆菌介导的球孢白僵菌遗传转化方法获得了3个敲除BbThi的缺失突变体,分别命名为△BbThi26,△BbThi33,△BbThi48。Southern杂交验证表明,外源片段以单拷贝整合到基因组中,3个突变体均无随机插入突变。3.2维生素B1含量测定VB1含量测定表明,突变体中VB1含量显著降低。插入突变体M936,同源重组菌株△BbThi26、△BbThi33、△BbThi48中VB1含量仅为野生型菌株的34.74%,31.01%,26.66%和27.28%,而超量表达BbThi菌株中VB1含量比野生型菌株高4.9%。3.3生物学分析（1）外源VB1能回复T-DNA插入突变体和同源重组突变体的缺陷表型,使产孢和菌落形态恢复正常。（2）敲除BbThi降低了球孢白僵菌的产孢量。插入突变体M936,同源重组菌株△BbThi26、△BbThi33、△BbThi48产孢量与野生型菌株相比分别减少了34.61%,66.94%,64.59%和61.09%,而超量表达BbThi菌株的产孢量与野生型菌株相当。（3）敲除BbThi不影响球孢白僵菌的分生孢子萌发率。野生型菌株,插入突变体M936,同源重组菌株△BbThi26、△BbThi33、△BbThi48和超量表达BbThi菌株的分生孢子萌发中时差异不显著。3.4生物测定敲除BbThi不影响球孢白僵菌的毒力。在107个/mL分生孢子浓度下,插入突变体M936,同源重组菌株△BbThi26、△BbThi33、△BbThi48,超量表达BbThi菌株对桃蚜的半致死时间(LT50)与野生型菌株差异不显著。上述结果表明,BbThi参与了球孢白僵菌VB1的合成,影响球孢白僵菌的生长形态和产孢量,但对球孢白僵菌的分生孢子萌发率和菌株毒力影响不显著。