研究背景肠道微生物菌群与人类健康的关系在近年来受到了广泛关注。氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide,TMAO）是一种肠道微生物菌群代谢产物,胆碱或左旋肉碱等食物前体进入人体肠道以后,在肠道微生物菌群的作用下分解为中间产物三甲胺（Trimethylamine,TMA）,TMA吸收入血后进一步在肝脏含黄素单加氧酶（Flavin-containing monooxygenases,FMO）作用下氧化为 TMAO。几宗大型的临床研究显示,TMAO与心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的关系十分密切,CVD患者的血浆TMAO水平与对照组相比明显升高,并且与动脉粥样硬化的严重程度呈剂量依赖性关系,可显著增加主要不良心血管事件（Major adverse cardiovascular events,MACE）如死亡、心肌梗死、中风等的发病风险。动物实验亦显示,采用胆碱或TMAO喂养小鼠可引起小鼠TMAO循环水平的增高,导致或加重动脉粥样硬化,诱导心肌细胞肥大、加重心肌纤维化及心脏功能恶化。在TMAO生成过程中,肠道菌群TMA裂解酶将胆碱等前体物质转换为TMA是整个代谢过程中最为关键的步骤。碘甲基胆碱（Iodomethylcholine,IMC）是Stanley Hazen等人通过长期研究和设计筛选出的肠道菌群TMA裂解酶抑制剂,可通过抑制TMA裂解酶的活性有效减少胆碱饮食小鼠体内TMA乃至TMAO的生成,降低动脉粥样硬化及血栓栓塞风险。慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是全球范围内严重影响人类健康的主要疾病之一。CKD与CVD的关系十分密切,研究显示随着CKD患者肾功能的不断恶化,其心血管事件的发病率亦明显增加,并且与以CVD为主要病因的早死密切相关。人体循环中的TMAO主要经肾脏排泄,CKD时肾功能的减退导致TMAO排泄减少和清除不足,从而导致TMAO在体内蓄积,使得CKD患者成为了天然的高TMAO人群。研究表明,高循环水平的TMAO可显著增加CKD患者的CVD发病风险及死亡风险。因此,如能有效降低CKD患者的TMAO循环水平,极有可能在一定程度上减轻CKD相关的心血管损害。另一方面,有研究发现,胆碱或TMAO饮食可直接引发小鼠的肾脏纤维化和肾功能损害,提示升高的TMAO循环水平不仅是肾脏功能减退的结果,更可以作为病因反过来进一步加重肾脏损害,造成恶性循环。因此,降低CKD患者的TMAO循环水平,可能不仅有利于减少CKD相关的心血管并发症,更有利于保护肾脏本身,延缓CKD的肾脏病变进展。鉴于TMAO对人类健康与疾病的重大影响,广大研究学者一直不断探索和寻找TMAO发挥生物学效应的具体分子机制。Marcus Seldin等人已经证明TMAO可以诱发血管内皮细胞炎症,其中NF-κB信号通路的激活在这一反应中发挥了重要作用。最近,Sifan Chen等人在肝细胞中证明了TMAO可以参与细胞内质网未折叠蛋白反应（Unfolding protein response,UPR）中的一条通路,即TMAO可直接与肝细胞内质网的PERK蛋白相结合,证实了 PERK为TMAO的直接作用靶点,这为研究TMAO的生物学效应及分子机制提供了新的思路。以往的研究表明,PERK信号通路在NF-κB的激活方面具有重要作用:正常情况下NF-κB被IκBα结合以维持其非激活状态,而PERK可通过激活其下游的eIF2α而降低IκBα的转录水平,导致未被结合的自由形式的NF-κB含量增多,于是有更多的NF-κB进入细胞核而被活化。鉴于以上理论基础我们不禁联想,如果TMAO能对NF-κB信号通路起激活作用,那很有可能是通过PERK信号途径实现的,然而目前尚未见类似方面的报道。为此,本课题拟从整体动物水平和细胞水平两个层面,研究肠道菌群TMA裂解酶抑制剂IMC能否有效降低CKD小鼠的TMAO循环水平,以及抑制TMAO生成后能否延缓CKD小鼠的肾脏病变进展并对CKD相关心血管损害起到改善作用,同时利用体外实验探讨PERK、NF-κB信号通路在TMAO诱导的肾脏损伤中的作用,阐明TMAO导致肾脏损伤的具体分子机制,为揭示TMAO的生物学效应提供新的思路,为CKD及相关心血管损害的干预和治疗提供新的靶点,为TMA裂解酶抑制剂应用于临床提供理论依据。研究目的（1）通过腺嘌呤喂养构建CKD的小鼠模型,观察TMAO水平与肾脏损伤的关系,同时探讨IMC抑制TMAO生成后,能否延缓CKD小鼠的肾脏病变进展,改善肾功能;（2）体外条件下,研究TMAO对肾脏上皮细胞的损伤作用,通过观察PERK、NF-κB信号通路的改变及相关抑制剂的阻断作用,探索TMAO导致肾脏损伤的具体分子机制;（3）观察CKD小鼠相关心血管损害的表现及严重程度,明确IMC抑制TMAO生成能否改善CKD相关的心血管并发症。研究方法1动物模型动物实验1:采用腺嘌呤喂养的方法建立CKD小鼠模型。选择4周龄的健康雌性apoE敲除小鼠,按照以下饮食随机分为4组:（1）普通饮食组（Con组）;（2）普通饮食+0.06%IMC组（Con+IMC组）;（3）普通饮食+0.2%腺嘌呤组（Ade组）;（4）普通饮食+0.2%腺嘌吟+0.06%IMC组（Ade+IMC组）。喂养12周末,将每只小鼠单独放入代谢笼中过夜,收集24h尿液。喂养14周末,处死小鼠并留取组织及空腹血,称取各器官重量。动物实验2:选择4周龄的健康雌性apoE敲除小鼠,按照以下饮食随机分为2组:（1）普通饮食组（Con组）;（2）普通饮食+腺嘌呤组（Ade组）,共喂养24周,其中Ade组前14周饮食中腺嘌呤的含量为0.2%,后10周腺嘌呤的含量为0.15%,Con组饮食保持不变。喂养24周末,行小鼠超声心动图检查后处死小鼠,留取血液标本及组织用于后续实验。2超声心动图检查采用二维、M型超声心动图技术观察小鼠左室肥厚情况,获取小鼠心脏的室间隔（Interventricular septum,IVS）厚度、左室内径（Left ventricular internal dimension,LVID）、左室后壁（Left ventricular posterior wall,LVPW）厚度、左室体积（Left ventricular volume,LV Vol）、左室质量（LV mass）、左室质量/体重比值（LV mass/Body weight）、左室射血分数（LV ejection fraction,LVEF）等指标。3生化指标检测质谱分析法检测血浆TMA、TMAO、肌酐和吲哚酚硫酸盐的含量。比色法检测血浆尿素水平。ELISA法检测血浆成纤维细胞生长因子23（Fibroblast growth factor 23,FGF23）、胱抑素C的含量。尿白蛋白及尿肌酐水平分别用ELISA和比色法进行测定,计算尿白蛋白/肌酐比值（Albumin to creatinine ratio,ACR）。采用酶比色法检测血浆总胆固醇（Total cholesterol,TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、甘油三酯（Triglyceride,TG）的含量,计算极低密度/中间密度/低密度脂蛋白胆固醇（Very low density/Intermediate density/Low density lipoprotein cholesterol,VLDL/IDL/LDL-C）的含量。TNF-α 和IL6的测定采用ELISA方法进行。4 组织病理学检测小鼠肾脏组织石蜡切片,Masson染色检测小鼠肾脏的胶原沉积,计算胶原含量及肾皮质瘢痕面积。小鼠主动脉根部冰冻切片,油红O染色观察小鼠主动脉根部的脂质染色区域并对其进行定量（斑块面积）。小鼠主动脉根部冰冻切片,茜素红染色观察小鼠主动脉根部的阳性染色区域并对其进行定量（钙化面积）。5细胞培养与实验分别培养小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞（Murine inner renal medullary collecting duct cells,mIMCD3）、正常人原代肾近曲小管上皮细胞（Normal human primary renal proximal tubule epithelial cells,RPTEC）和 Madin-Darby 犬肾脏 Ⅱ 型上皮细胞（Madin-Darby canine kidneyⅡcells,MDCKⅡ）,采用不同浓度的 TMAO刺激上述3种肾脏上皮细胞,留取细胞用于提取RNA或总蛋白。另取MDCKⅡ细胞,于6孔板中培养24h后,分为以下4组进行抑制剂干预实验:（1）Control组:正常培养液;（2）Inh组:正常培养液+100nMNF-κB抑制因子Ⅳ;（3）TMAO组:正常培养液+200μM TMAO;（4）TMAO+Inh组:正常培养液+200μM TMAO+100nMNF-κB抑制因子Ⅳ。给予上述刺激48h后,留取细胞用于提取细胞RNA。最后培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,采用不同浓度的TMAO进行刺激,留取细胞用于提取RNA。6 RNA提取及实时定量RT-PCR根据制造商提供的说明,使用miRNeasy Mini试剂盒或Qiazol法从组织或细胞样本中分离总RNA。采用高效cDNA反转录试剂盒合成cDNA。应用基因特异性引物和SYBR green荧光染料在罗氏Lightcycler 480系统中进行实时定量RT-PCR。7 RNA测序使用Illumina（?）TruSeqTM试剂盒制备RNA文库。插入条形码后,采用50bp单端测序法在HiSeq4000上进行测序。使用FastQC软件对测序数据进行质控分析。使用STAR aligner version 2.3.1将序列读断对比到小鼠基因组上。计数数据采用DESeq2比率中值法进行标准化。使用DEseq2进行差异表达分析。采用DAVID 6.8进行基因本体分析,获得富集的信号通路。8 Western blot分离并提取处理后的MDCKII细胞蛋白。Western blot检测磷酸化NF-κB p65、总 NF-κB p65、磷酸化 PERK、总 PERK、磷酸化 eIF2α、总 eIF2α、磷酸化 IRE1α、总IRE1α、ATF4和GAPDH的蛋白表达水平。9统计分析两组间比较采用独立样本t检验。对于单因素实验设计,采用单因素ANOVA方差分析及Turkey多重检验,对于双因素实验设计,采用双因素ANOVA方差分析及Holm-Sidak post hoc多重检验。所有的统计过程均通过软件GraphPad Prism version 8完成,以P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1IMC可降低CKD小鼠的血浆TMAO水平14周喂养结束后（动物实验1）,与Con组相比,Con+IMC组小鼠的血浆TMAO水平明显下降,TMA水平亦具有下降趋势,证明了 IMC抑制TMAO生成的有效性。与Con组相比,Ade组小鼠的血浆TMAO水平明显升高,提示CKD小鼠体内存在TMAO的蓄积。而Ade+IMC组小鼠的血浆TMAO水平较Ade组明显下降,且TMA水平与Ade组相比亦具有下降趋势,提示IMC可有效降低CKD小鼠的血浆TMAO水平。2抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的肾脏功能与Con组相比,Ade组小鼠的血浆肌酐、尿素、胱抑素C等肾脏损伤标志物的水平明显升高,提示腺嘌吟可引起小鼠肾脏功能损害,导致CKD。而Ade+IMC组小鼠与Ade组相比,上述标志物的循环水平显著下降,提示IMC减轻了腺嘌呤导致的肾脏功能损害。另外,Ade组小鼠的吲哚酚硫酸盐毒素的循环水平较Con组升高,尿ACR亦显著增加,而Ade+IMC组小鼠的上述指标明显降低,提示抑制TMAO生成可显著改善CKD小鼠的肾脏功能。同时,各组小鼠的日平均进食量没有明显差别,排除了饮食摄入不平衡对实验结果的影响。3抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的肾脏病理改变Masson染色检测小鼠肾脏组织中的胶原沉积,计算胶原含量及皮质瘢痕面积。结果显示,Con组及Con+IMC组小鼠的肾脏组织学基本正常,而Ade组和Ade+IMC组小鼠肾脏中均出现了胶原的沉积及皮质瘢痕等病理改变。定量结果进一步显示,Ade+IMC组小鼠肾脏的胶原含量及皮质瘢痕面积虽较Con组增加,但仍显著少于Ade组,提示抑制TMAO生成可在一定程度上减轻腺嘌呤导致的肾脏病理改变。4抑制TMAO生成可减轻腺嘌吟引起的肾脏炎症和纤维化、改善肾脏代谢状态实时定量RT-PCR结果显示,Ade组小鼠肾脏中Ccl2、Ccl20、Lcn2等炎症基因及Col1a1、Col3a1等纤维化基因的表达显著增加,而IMC可显著降低上述基因的表达水平。RNA测序及David通路分析结果显示,与Ade组相比,Ade+IMC组小鼠肾脏中细胞外基质、蛋白酶抑制剂、补体与凝血级联、免疫、细胞因子等方面的表达水平下调,而在脂质代谢、线粒体、离子转运、内质网、细胞水稳态等方面的表达水平上调,提示IMC可减轻腺嘌呤引起的肾脏炎症和纤维化,并显著改善CKD小鼠肾脏的整体代谢状态。5 TMAO可导致肾脏上皮细胞炎症采用不同浓度的TMAO处理上述3种类型的肾脏上皮细胞。在mIMCD3细胞中,与空白对照组相比,20mM TMAO组细胞内Il1β基因的表达水平明显上调,40mMTMAO组细胞内Il1β、MIP2和Lcn2基因的表达水平均明显上调。在RPTEC细胞中,与空白对照组相比,200μMTMAO组细胞内CCL2基因的表达明显上调,400μM TMAO组细胞内CCL2和TNF-α基因的表达明显上调。在MDCKⅡ细胞中,实时定量RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,50μM、100μM、200μMTMAO组细胞内多个炎症基因的表达水平均显著增加,包括IL8、CCL2、CCL20等。通过以上结果可以确定,TMAO可导致肾脏上皮细胞炎症。而UPR反应中PERK信号通路下游相关基因的表达并没有明显变化,包括ATF4和CHOP。6 TMAO可激活肾脏上皮细胞的NF-κB信号通路采用200μM TMAO刺激MDCKⅡ细胞48h,Western blot检测相关通路的蛋白含量。结果显示,TMAO刺激48h后MDCKⅡ细胞内磷酸化NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65/总NF-κB p65的比值均显著增加,提示TMAO可能通过激活肾脏上皮细胞的NF-κB信号通路发挥生物学效应。而内质网应激相关通路蛋白,包括磷酸化PERK/总PERK、磷酸化eIF2α/总eIF2α、磷酸化IRE1α/总IRE1α及ATF4的表达均未见明显变化,提示内质网未折叠蛋白反应可能与TMAO导致的肾脏上皮细胞炎症并无明显关联。7 NF-κB抑制剂可阻断TMAO的促炎作用将 MDCKⅡ 细胞分为 Control 组、Inh 组、TMAO 组、TMAO+Inh 组（详见上述方法部分）。实时定量RT-PCR检测各组细胞中炎症基因的表达情况。结果显示,TMAO组细胞内炎症基因的表达水平显著增高,与上述结果相一致;而TMAO+Inh组与TMAO组相比,其细胞内炎症基因包括IL8、CCL2、CCL20的表达水平显著降低,提示NF-κB抑制剂可以阻断TMAO对MDCKⅡ细胞的促炎作用,证实了 NF-κB信号通路在TMAO生物学效应中的关键作用。8 TMAO对巨噬细胞亦具有促炎作用巨噬细胞在腺嘌呤诱导的CKD形成过程中发挥重要作用。为明确TMAO是否亦对巨噬细胞产生影响,我们采用含200μM TMAO的培养液孵育RAW264.7巨噬细胞,24h后发现其细胞内炎症基因的表达水平明显上调,包括Cox2、Il1β、MIP2和TNF-α等。因此,TMAO不仅对肾脏固有上皮细胞具有促炎作用,亦可诱发巨噬细胞炎症,从多个方面加重肾脏损伤。9抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的心肌肥厚喂养14周末,分别称取Con组、Con+IMC组、Ade组、Ade+IMC组各组小鼠的体重及心脏重量,计算心脏/体重比值。结果显示,Con组与Con+IMC组小鼠的心脏/体重比值无明显差异,而Ade组小鼠的心脏/体重比值显著增加,提示CKD小鼠存在心肌肥厚。与Ade组相比,Ade+IMC组小鼠的心脏/体重比值明显下降,达正常水平,提示抑制TMAO生成可减轻CKD小鼠的心肌肥厚。FGF23是一种骨源性激素,已被证明可引起左心室肥厚。我们检测了各组小鼠体内FGF23的循环水平,结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠的FGF23循环水平显著增加,而Ade+IMC组小鼠的FGF23循环水平较Ade组相比显著下降,提示补充IMC可显著降低腺嘌呤喂养导致的高FGF23血症,部分解释了 Ade+IMC组小鼠心肌肥厚改善的原因。10抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的血脂代谢紊乱测量上述4组小鼠的血脂水平。结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠的TG、TC、VLDL\IDL\LDL-C的含量均明显上升,提示腺嘌呤喂养加重了 apoE敲除小鼠的高脂血症。而Ade+IMC组与Ade组相比,其TC、VLDL\IDL\LDL-C的水平均显著下降,提示抑制TMAO生成可改善CKD小鼠的血脂代谢紊乱。11抑制TMAO生成对CKD小鼠血管病变的影响采用油红O染色对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积进行检测和定量分析,结果显示以上4组小鼠的平均动脉粥样硬化斑块面积并没有明显差异。采用茜素红染色对小鼠主动脉根部动脉钙化面积进行检测和定量分析,各组小鼠的平均动脉钙化面积亦没有明显差异。以上结果提示腺嘌呤所致的CKD小鼠模型并没有出现动脉粥样硬化或动脉钙化的加剧,因而本次实验无法观察抑制TMAO生成对CKD小鼠动脉粥样硬化及动脉钙化的影响。提取各组小鼠主动脉RNA行实时定量RT-PCR。结果显示,与Con组、Con+IMC组相比,Ade组、Ade+IMC组小鼠主动脉中炎症基因Ccl2、Cox2、116、Vcam1的表达水平均显著降低,表明腺嘌呤本身可显著降低小鼠主动脉局部的炎症反应。腺嘌呤是腺苷代谢合成的底物,腺苷受体在抑制血管炎症方面具有重要作用。我们检测了小鼠主动脉中腺苷受体基因的表达水平,结果发现,与Con组相比,Ade组小鼠主动脉中A2B型腺苷受体的表达具有明显变化,提示腺苷-腺苷受体途径可能参与了腺嘌呤对动脉粥样硬化的保护过程。12延长腺嘌吟喂养周期对CKD小鼠动脉粥样硬化的影响动物实验2中我们将腺嘌呤喂养周期延长到24周。生存曲线显示Con组小鼠在整个实验周期中未发生死亡,Ade组小鼠在实验结束时,有半数的小鼠出现死亡。从第12周起,两组小鼠的体重开始出现差异,Ade组小鼠的体重水平显著低于Con组。实验结束时,Ade组小鼠体内的血浆肌酐、尿素、胱抑素C和TMAO水平较Con组显著升高,并且其血浆TNF-α和IL6的水平也显著升高,提示腺嘌呤喂养加重了 apoE敲除小鼠的炎症状态。再次采用油红O染色对小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块面积进行检测和定量分析,结果发现,Con组与Ade组小鼠之间的平均动脉粥样硬化斑块面积仍然没有明显差异。13延长腺嘌吟喂养周期对CKD小鼠心肌肥厚的影响实验结束时对小鼠进行心脏超声检测,结果显示,与Con组相比,Ade组小鼠心脏舒张末期的 IVS、LVID、LV Vol、LV mass 和 LV mass/Body weight 均显著增加,LVPW具有增加趋势但尚未达统计学意义,LVEF在两组之间没有明显差别。小鼠处死后称取实际的心脏重量,计算心脏/体重比值,Ade组小鼠的心脏/体重比值显著高于Con组。上述结果再次证实了腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型存在心肌肥厚的并发症,由于心室壁厚度和心室腔内径几乎同比例增加,因而此模型下的心肌肥厚可能以离心型肥厚为主要改变。研究结论（1）腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型中存在TMAO循环水平的增高,肠道菌群TMA裂解酶抑制剂IMC可通过抑制TMAO生成减轻CKD小鼠的肾脏炎症及纤维化等损伤,并显著改善肾功能;（2）体外实验证实TMAO可诱导肾脏上皮细胞炎症,其中NF-κB信号通路在此过程中发挥了关键作用,巨噬细胞炎症也可能参与了TMAO导致的肾脏损伤过程;（3）腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型存在心肌肥厚并发症,应用IMC抑制TMAO生成可显著改善心肌肥厚,减轻CKD相关心血管损害。