植入前遗传学诊断(PGD)是指对配子和种植前胚胎的遗传学诊断，把筛选遗传缺陷提早到早早期胚胎阶段。通过去除有遗传缺陷的胚胎，可以有效地避免传统的产前诊断发现异常胚胎后的治疗性流产或引产的要求，因而受到生殖界的广泛关注。这项技术从90年代开展以来，据统计目前世界上已进行了6000多个PGD周期，至少1000个左右的经PGD诊断后的正常孩子出生，为许多因为遗传疾患而不能正常生育的夫妇带来了希望。　　 全基因组扩增(WGA)是一项以有限的DNA为模板，非选择性扩增整个基因组以增加DNA数量的技术。该技术极大地改善了PGD仅有一个细胞可供分析所带来的困境，使模板量从皮克级(pg)升高到微克级(μg)。目前，使用较多的WGA方法主要包括引物延伸预扩增(PEP)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、联结子-衔接子PCR(LA PCR)和多重置换扩增(MDA)。DOP-PCR与PEP同样是以PCR为基础的全基因组扩增技术，其单细胞扩增产物的基因组覆盖率最高分别为89％和91％，但是两者都有难以克服的缺陷，包括扩增效率低、产量少(PEP)、产物片段短(PEP和DOP-PCR)、明显的ADO和扩增偏倚(PEP和DOP-PCR)等。这一切都限制了PEP和DOP-PCR在PGD领域的广泛应用。LA PCR被广泛应用于生产FISH探针，但是目前利用该技术作单细胞遗传分析的研究仍然较少。得益于所使用的φ29聚合酶的高持续合成能力和优秀的校读活性，MDA具有远优于PEP和DOP-PCR的准确率和扩增效率，已被越来越多地应用于PGD临床。　　 但是MDA本身仍有很多缺陷，在进行单细胞扩增时尤其明显。ADO是评价任何应用于PGD的新技术的重要指标，对于单细胞MDA，不同研究得出的ADO率相差较大，介乎0-60％，而且不同位点之间也有很大差异。这些研究主要是利用遗传标记物(STRs或者SNPs)对MDA产物的基因组覆盖率和保真度(ADO率)进行评估，由于每一个遗传标记都需要建立一套PCR反应，所以这些研究只能纳入数量有限的标记进行分析(最多为64个多态位点，分别位于7条不同的染色体上)，这导致无法测定单细胞MDA的一些重要指标:包括完整全面的基因组覆盖率和ADO位点在基因组上的分布规律，同时，研究发现MDA即使在没有模板的情况下也会产生大量的非特异性产物，虽然单细胞MDA中的非特异性产物对后续的单重PCR反应影响不大，但是如果利用这些产物作多个位点分析甚至是比较基因组杂交(CGH)时，则需要进一步明确非特异性产物与非扩增的基因组DNA之间是否有重合及其程度，以避免对实验结果造成误差。所有这些都是对单细胞MDA的保真度进行全面评估所必需的。最后，PGD亦有可能活检两个卵裂球或更多的细胞(囊胚活检)进行检测，起始模板量的增加对最后MDA产物保真度的影响也是所关注的。目前，虽有学者进行过类似的研究，但是该实验仪纳入单个遗传标记，因此结果仅能提供一个粗略的倾向。综上所述，目前焏需一种能够在基因组水平对单细胞MDA的保真度作出全面而深入评估的平台和方法。　　 本研究的目的是利用10K2.O SNP基因分型芯片平台，探索不同数量细胞(1-10个)的MDA产物的保真度、可能相关因素以及MDA产物中非特异产物对后续实验的可能影响，为单细胞MDA应用于PGD领域做出全面而有效的评估。同时，利用同一芯片平台对不同数量细胞MDA产物的DNA拷贝数进行分析，了解使用不同参照对分析结果的影响，并确定进行MDA产物分析时的实际空间分辨率，建立利用Array-CGH技术诊断单细胞水平非整倍体的分析方法。　　 第一部分不同数量细胞MDA保真度的评估　　 目的:本研究利用IOK2.0 SNP基因分型芯片平台，探索不同数量细胞(1-10个)的MDA产物的保真度(包括检测基因组覆盖率和ADO率)、可能相关因素以及MDA产物中非特异产物对后续实验的可能影响，为单细胞MDA应用于PGD领域做出全面而有效的评估。　　 材料:纤维母细胞系GM02732(47，XY，+18)作为模板，共分7组进行实验，分别为A组(阳性对照，细胞gDNA，3例)、B组(阴性对照，无模板MDA，3例)、C组(单细胞MDA，6例)、D组(两个单细胞MDA产物的混合，6例)、E组(2细胞MDA，3例)、F组(5细胞MDA，3例)和G组(10细胞MDA，3例)。　　 方法:　　 1.细胞富集与抽提gDNA。　　 2.不同数量起始细胞的MDA扩增。　　 3.MDA产物的纯化与产量的测定。　　 4.细胞gDNA和MDA产物的切割、连接、选择性扩增与标记。　　 5.所得标记DNA片段与芯片杂交。　　 6.芯片的洗脱与扫描。　　 7.数据分析。　　 结果:　　 1.阴性对照组的MDA产物与gDNA序列可有5.3％的重叠。　　 2.随着起始模板从单细胞提升至10细胞，MDA产物的基因组覆盖率从86.2％逐步上升至98.7％，而间接反映特异性产物比例的判读率/信号率也从0.88上升至0.97。　　 3.单细胞组持续无判读信号的SNP位点所在片段的GC含量百分比为42.15％，显著高于芯片SNP位点的平均GC含量为39.86，其他各组未发现持续无信号的SNP位点所在片段GC含量较芯片平均水平显著升高，同样，各组中均未发现SNP位点的片段长度与无判读信号之间呈相关性。　　 4.随着起始模板从单细胞提升至10细胞，MDA产物的平均ADO率从17.88％逐渐下降至0.15％，各组之间比较均有统计学差异。此外，仅有4个SNP位点在同一实验组中出现一致性ADO现象(2个位于单细胞组，1+1细胞组和2细胞组各一个)。计算这些位点所在片段的GC含量百分比和长度分别为39.26±4.33％和604.25±67.69bp，与芯片上所有SNP位点的平均水平比较，差异无统计学意义。　　 5.MDA产物与阳性对照组SNP分析的符合率在单细胞组为78.4％，2细胞组的符合率(86％)略高于1+1细胞组(83.7％)，但两者之间没有统计学差异。　　 第二部分结合MDA和sNP基因分型芯片对单细胞水平的非整倍体进行分析　　 目的:本研究拟结合10K2.0 SNP基因分型芯片平台与MDA技术，对不同数量细胞MDA产物的DNA拷贝数进行分析，了解使用不同参照对分析结果的影响，并确定进行MDA产物分析时的实际空间分辨率，建立利用Array-CGH技术诊断单细胞水平非整倍体的分析方法。　　 材料:纤维母细胞系GM02732(47，XY+18)和GM00343(46，XY4(del)(qter>p14))作为模板，共分7组进行实验，其中A-F组使用GM02732细胞，G组使用GM00343细胞，分别为A组(阳性对照，细胞gDNA，3例)、B组(单细胞MDA，6例)、C组(两个单细胞MDA产物的混合，6例)、D组(2细胞MDA，3例)、E组(5细胞MDA，3例)、F组(10细胞MDA，3例)和G组(单细胞，3例)。　　 方法:同第一部分。　　 结论:　　 1.本研究首次利用SNP基因分型芯片平台，对不同数量细胞模板的MDA产物进行保真度分析，结果提示MDA是一种快速、高效和相对准确的全基因组扩增方法。　　 2.单细胞MDA的非特异性产物可有部分与基因组特异性序列重合，但数量极少。　　 3.单细胞MDA产物的ADO率最高可达29.5％，因此进行后续PCR时应至少纳入3个遗传标记作连锁分析以避免误诊。　　 4.2细胞MDA的保真度略高于两个单细胞MDA产物的混合物，提示如果进行两个或多个细胞的MDA时，应将细胞至于同一反应体系中进行扩增。　　 5.MDA产物进行染色体拷贝数分析时有明显的位点特异性优势扩增现象，应使用同样以MDA方法扩增的基因组DNA而不是非扩增的gDNA作为参照。　　 6.MDA产物进行拷贝数分析时的实际分辨率与芯片位点密度和其他多种因素有关，而且对缺失性改变的分辨率高于获得性改变，即前者比后者更容易被检出。