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目的原发性中枢神经系统淋巴瘤（Primary central nervous system lymphoma）,PCNSL是神经系统常见的一种罕见的侵袭性结外非霍奇金淋巴瘤（NHL）。局限于大脑,眼睛,脊髓或软脑膜,无全身受累。不同于其他外周性淋巴瘤,其中90%是中枢神经系统弥漫性大B细胞淋巴瘤（PCN-DLBCL）[1]。主要表现为颅内高压症状、神经系统症状以及智力降低和行为异常。由于该肿瘤的多灶性,外科手术切除不被认为是治疗PCNSL的标准治疗方法,化学治疗剂联合使用对于新诊断的PCNSL是最有效的治疗方法。但是对于淋巴瘤化疗的研究主要集中在细胞凋亡上,对于细胞坏死研究较少。程序性坏死对肿瘤细胞的抑制作用还没有完全阐明。本实验通过体外联合中枢统淋巴瘤的新型化疗药物Bcl-2抑制剂Venetoclax（ABT-199）与Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制剂Ibrutinib,研究受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）/研究受体相互作用蛋白激酶3（RIP3）介导的程序性坏死通路是否参与Venetoclax和Ibrutinib联合诱导的非霍奇金B淋巴瘤细胞SU-DHL-4死亡。以及联合方案诱导DLBCL细胞坏死中Necrostatin-1（Nec-1）对肿瘤细胞潜在的保护作用。方法1.细胞毒性/增殖检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）测定检测细胞增殖情况。计算Venetoclax（0、10、20、30、40、50、60μmol/L）、Ibrutinib（0、5、10、15、20、25、30μmol/L）不同浓度单药及固定低浓度Ibrutinib（2μmol/L）联合不同浓度Venetoclax（5、10、15、20、25、30μmol/L）处理后的细胞增殖抑制率,取均值计算增殖抑制率,计算联合用药后Ibrutinib的IC50。通过计算两药相互作用系数（coefficient of drug in interaction,CDI）确定两药是否存在联用效力。2.细胞凋亡与坏死检测试剂盒（Apoptosis and Necrosis Assay Kit）测定给予不同浓度的Venetoclax、Ibrutinib（0、5、10、20μmol/L）作用SU-DHL-4细胞24 h后测定各组碘化丙啶（PI）阳性细胞率,固定低浓度Ibrutinib（5μmol/L）联合不同浓度Venetoclax（0、5、10、20μmol/L）处理后测定各组碘化丙啶（PI）阳性细胞率。用Necrostatin-1、z VAD分别预处理单药干预以及联合方案诱导的SU-DHL-4细胞,24 h后分别测定各组PI+细胞数,计算细胞坏死率。3.设置实验对照组、Venetoclax（10μmol/L）、Ibrutinib（5μmol/L）单药组,固定低浓度Ibrutinib（5μmol/L）联合固定浓度Venetoclax（10μmol/L）处理SU-DHL-4细胞24 h后,一部分收集肿瘤细胞提取总蛋白Western blotting检测程序性坏死相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL、CAMKII、Caspase3、Caspase8的表达规律,其中一部分通过ROS活性氧试剂盒检测各组细胞内活性氧的水平,利用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测观察细胞线粒体膜电位的变化,另一部分细胞样本用于制备透射电镜标本,电子显微镜观察凋亡细胞形态学的特征性改变。4.si RNA敲低SU-DHL-4细胞RIP1水平。使用联合化疗方案诱导肿瘤细胞死亡,借此来研究RIP1/RIP3通路对联合化疗方案的影响。细胞转染后培养48 h并收集细胞,进行药物处理。将细胞分为Venetoclax（10μmol/L）单药组、Ibrutinib（5μmol/L）单药组、实验对照组及Venetoclax、Ibrutinib（10μmol/L、5μmol/L）联用组,24 h后分别测定各组PI+细胞数用来计算细胞坏死率。其余细胞培养至48 h后收集进行Western blot分析。结果1.Venetoclax联合Ibrutinib作用于SU-DHL-4细胞的两药相作用系数均CDI<1,证明两药存在联用效力。2.单用Ibrutinib可显著增加SU-DHL-4细胞死亡。Ibrutinib单药干预诱导死亡细胞数可被z VAD抑制,Necrostatin-1组细胞无变化。同时Venetoclax联合Ibrutinib可显著诱导SU-DHL-4细胞的死亡细胞数上升,且细胞死亡可被Necrostatin-1下调。3.Western blot发现Venetoclax联合Ibrutinib可增加RIP3、CAMKⅡ的表达,较实验对照组以及单药组明显升高。联合用药组SU-DHL-4细胞内活性氧的水平明显增高;线粒体膜电位下降;4.敲低RIP1水平可显著减低Venetoclax、Ibrutinib联合化疗方案诱导SU-DHL-4细胞的死亡。结论Ibrutinib具有抗非霍奇金性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞作用,与Venetoclax联合应用可提高Ibrutinib抑制DLBCL细胞的增殖效果。抑制作用可能是由于Venetoclax、Ibrutinib联合激活了RIP1/CAMKⅡ通路最终ROS导致SU-DHL-4弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞的死亡。Necrostatin-1可能在治疗中保护SU-DHL-4 DLBCL的存活。