背景革兰氏阴性菌产生的脂多糖(LPS)能直接激活哺乳动物的单核巨噬细胞产生大量炎症介质,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等,这些炎症介质能直接或间接地对细胞和组织产生损伤作用。在慢性肝病病人和一些肝病动物模型中,肠道菌群紊乱和屏障功能失调的情况普遍存在,由此导致肠道来源的LPS移位进入肝脏,进一步恶化肝脏功能。益生菌是一类能对机体产生有益作用的细菌。在一些与LPS相关、并存在肠道屏障功能失调的肝病模型中(如酒精或D-半乳糖胺诱导的肝病模型),益生菌被报道能抑制肝损伤和炎症反应。益生菌在这些模型中的有益作用依赖两点：首先,必须在肝病模型构造前用合适剂量的益生菌处理适当的时间；其次,在大多数情况下,它们的作用机制被推测是通过降低肠道屏障通透性、从而减少肠道来源LPS移位至肝脏而间接实现的。从另一个角度看,益生菌不仅能直接调节健康人或者实验动物的肠道免疫功能,还有可能对肝脏的免疫功能产生影响作用。如肠腔内细菌合成的、具有抗炎症作用的短链脂肪酸,能通过门静脉进入肝脏；另外,已有的研究表明,肠腔内共生菌能影响肝脏树突状细胞的免疫功能。鉴于此,我们提出,益生菌在LPS相关的肝病模型中的预防机制,除了保护肠道屏障功能外,是否还有其它机制?如用益生菌预先处理实验动物后,是否能影响肝脏的免疫功能从而使得肝脏能直接对抗LPS诱导的损伤或炎症反应?为此,我们希望构建一个LPS诱导的动物肝损伤模型：它不同于酒精或D-半乳糖胺诱导的肝损伤模型,即不存在肠道屏障通透性的改变及细菌移位至肝脏,从而尽可能地排除肠道来源的LPS及其它细菌成分对肝脏病理进程的干扰。如果可能,我们用该模型来进一步研究筛选出的益生菌预先处理动物后,对肝脏损伤和炎症反应的干预作用。方法构建LPS诱导的肝损伤模型：用不同剂量LPS(IP；单次处理)处理C57/BL6小鼠后,检测肠道屏障通透性的变化情况和细菌移位至肝脏的情况。为了进一步研究肠道内源性共生菌对LPS诱导的肝损伤的影响,我们比较分析未清肠小鼠和用广谱抗生素清肠的小鼠在LPS诱导的血清丙氨酸转氨酶(ALT)及肝脏TNF-a表达水平上的差异。如果某个剂量的LPS处理后,肠道屏障通透性的无显著变化,肠道共生菌也没有显著影响LPS诱导的ALT和肝脏TNF-a表达水平,则进一步研究益生菌菌株预先处理对该剂量的LPS诱导的肝损伤的干预作用。用不同剂量的Lactobacillus fermentum ZYL0401(LF41)、Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)、Bifidobacterium catenulatum ZYB0401(BC41)(这些菌株悬于500μl PBS中)、或5001μl PBS处理(IG；每天一次)小鼠不同天数,接着用LPS处理,并检测LPS处理后的肝损伤和炎症因子表达情况(如检测血清ALT水平、分析肝脏组织学变化、检测肝脏及血清TNF-a表达水平等)。益生菌的作用机制研究：对LPS诱导的肝损伤有显著抑制作用的益生菌菌株,进一步探索其作用机制。1)评估细菌的作用：如确定益生菌预先处理后小鼠盲肠和粪便短链脂肪酸的水平、肠道通透性是否改变、肠道内源性共生菌是否影响菌株处理后肝脏对LPS的拮抗作用、以及菌株在体外是否能直接抑制LPS诱导的巨噬细胞TNF-a表达等。2)分析益生菌菌株处理后机体免疫功能的变化及作用：首先确定菌株菌种16S rRNA在不同肠段组织的水平,从而筛选出浓度最高的“靶向肠段”；其次,结合已经获得的一些实验数据及文献参考,筛选出需检测的免疫相关的介质及确定它们在“靶向肠段”的基因或蛋白表达情况；如果出现表达显著改变的介质,则进一步分析其在肝脏的表达情况,并研究它们与菌株处理后肝脏获得的拮抗LPS的损伤作用是否相关。结果用低剂量LPS处理小鼠(0.5mg/kg BW)后,血清ALT和肝脏TNF-a mRNA的表达水平显著上调。相比未清肠对照处理,抗生素清肠并无显著影响LPS诱导的二者的水平。另外,该模型中也不存在肠道屏障通透性的显著变化和细菌移位至肝脏。高剂量LF41(H-LF41)处理小鼠10天显著抑制LPS诱导的血清ALT水平、肝脏及血清TNF-a mRNA和蛋白的表达水平、以及肝脏炎症细胞的浸润。而灭活的高剂量LF41、低剂量LF41(L-LF41)、高剂量LGG、和高剂量BC41均对LPS诱导的ALT和肝脏TNF-a mRNA水平无显著作用。另外,H-LF41处理小鼠21天对LPS诱导的ALT和肝脏TNF-a mRNA水平无显著影响。用H-LF41处理小鼠10天后：回肠前列腺素E2(PGE2)的分泌和肝脏PGE2的含量均显著增加；回肠上皮细胞环氧合酶-2(COX-2)的表达显著上调,而肝脏COX-2和COX-1的表达均无显著变化。H-LF41处理10天上调回肠黏膜固有层细胞IL-10的表达水平而对肝脏IL-10水平无显著作用,但扩增了LPS诱导的肝脏IL-10的水平。外源给予的PGE2处理亦显著扩增LPS诱导的肝脏IL-10水平。H-LF4联合EP-4受体抑制剂处理10天后,H-LF41介导的对LPS诱导的肝脏TNF-a mRNA水平的抑制作用消失了；同样地,PGE2处理亦显著抑制LPS诱导的肝脏TNF-amRNA水平。H-LF4联合IL-10中和抗体处理10天终结了H-LF41介导的对ALT水平的抑制作用。PGE2处理显著抑制LPS诱导的ALT表达。H-LF4联合COX-2抑制剂处理10天,不仅终结H-LF41介导的对回肠和肝脏PGE2表达的上调作用,而且还消除了其对LPS诱导的肝脏IL-10水平的扩增作用。相比H-LF41单独处理10天,H-LF41联合COX-2抑制剂处理10天显著促进肝脏单个核细胞和回肠组织TNF-a的表达,并且显著增高由TNF-α介导的肠道上皮细胞通透性。结论我们发现在低剂量LPS诱导的肝炎模型中,肠道来源的细菌成分对肝损伤与炎症因子的表达所起的作用可能很小。H-LF41预先处理10天能显著拮抗LPS对肝脏的损伤作用及对TNF-a表达的促进作用。H-LF41处理10天影响了小鼠的固有免疫：即上调了肝脏PGE2水平,但不伴随肝脏COX-2和COX-1表达的增强；促进了回肠PGE2分泌,且伴随回肠COX-2表达的上调。此外,H-LF41处理10天扩增了LPS诱导的肝脏IL-10表达。重要的是,H-LF41处理诱导的PGE2和IL-10赋予了肝脏拮抗LPS诱导的肝损伤和炎症因子表达的能力。H-LF41介导的对肝脏PGE2和IL-10水平的上调作用都受COX-2的控制。COX-2在H-LF41处理10天的小鼠还作为一个预防机制：即阻止了回肠和肝脏细胞TNF-α表达的上调及由TNF-α介导的肠道通透性的增加。综上,LF41介导的对LPS诱导的肝损伤和炎症因子表达的预防机制是对益生菌在肝病模型中已呈现的预防机制的一个重要补充。