肝纤维化是多种非自限性的慢性肝脏疾病向肝硬化进展的中间病理过程,是威胁人类健康的常见疾病,也是原发性肝癌发病的危险因素之一。世界现代肝病学者奠基人、美国肝病鼻祖Hans Popper教授指出“谁能阻止或延缓肝纤维化的发生,谁将治愈大多数慢性肝病”。现代研究发现,肝纤维化是可以预防、干预、甚至逆转的。然而,迄今为止国际上尚未出现安全有效、肝脏特异性靶向以及耐受性较好的化学药物被美国FDA(Food and Drug Administration)批准用于人类肝纤维化的治疗。在我国,国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration,CFDA)批准以肝纤维化为适应证的中药主要有扶正化瘀胶囊(片)和复方鳖甲软肝片。六味五灵片(Liuweiwuling tablets,LWWL)是治疗慢性乙型肝炎氨基转移酶升高的国家六类新药,具有保肝降酶持久、反跳慢的优势。临床研究发现LWWL联合核苷(酸)类药物用于治疗慢性乙型肝炎肝纤维化疗效显著,因此本研究全面检索其临床随机对照研究(randomized controlled study,RCT)并进行Meta分析。在揭示LWWL对慢性乙型肝炎相关肝纤维化具有潜在的治疗作用的基础上,进一步客观评价LWWL抗肝纤维化药效学作用。采用胆管结扎(bile duct ligation,BDL)、四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)导致的实验性大鼠肝纤维化模型,从保肝、抑制胶原纤维生成、抑制肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化、增殖及趋化、减少细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的生成、促进ECM降解等方面评价了LWWL抗肝纤维化的量效关系,并初步探讨其潜在的作用机制,发现与药效与负调控TGF-β/Smad和NF-κB信号通路介导的胶原合成和免疫炎症反应有关。本研究从临床研究启发基础研究再回归临床的研究思路,以期为LWWL二次开发扩大临床适应症提供参考依据,同时为临床肝纤维化的治疗提供一些新的方法和思路。本课题的具体研究内容如下:第一部分六味五灵片联合核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的系统评价目的:系统评价LWWL联合核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎肝纤维化有效性及安全性。方法:计算机检索Pubmed、Embase、Cochrane Library(2015年第9期)、中国生物医学数据库(CBM)、中国期刊全文数据库(CNKI)、中文科技期刊全文数据库(VIP)、万方数据在线知识服务平台,全面收集有关LWWL联合核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的随机对照试验(randomized controlled trial,RCT),检索时限均从建库至2015年10月29日。由2位评价员按照纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料和评价纳入研究的方法学质量后,采用Rev Man5.3软件进行meta分析。结果:最终纳入7个RCTs,共1021例慢性乙型肝炎肝纤维化患者,其中治疗组529例,对照组492例。分析结果显示:与单用核苷(酸)类药物相比,LWWL联合核苷(酸)类药物不仅可降低慢性乙型肝炎肝纤维化患者血清肝纤维化指标HA[SMD=-1.26,95%CI(-1.92,-0.59),P=0.0002]、LN[SMD=-1.55,95%CI(-2.27,-0.83),P<0.0001]、PC-Ⅲ[SMD=-1.39,95%CI(-2.21,-0.58),P=0.0008]、Ⅳ-C[SMD=-1.49,95%CI(-2.25,-0.72),P=0.0001];还可以改善肝功能生化指标:ALT[SMD=-1.17,95%CI(-1.41,-0.94),P<0.00001]、AST[SMD=-1.25,95%CI(-1.54,-0.96),P<0.00001]、TBIL[SMD=-0.87,95%CI(-1.21,-0.53),P<0.00001];提高临床总有效率[OR=4.59,95%CI(2.05,10.25),P=0.0002];但并不能提高HBV DNA转阴率[OR=1.51,95%CI(0.96,2.39),P=0.08];此外,无明显不良反应报道。结论:LWWL联合核苷(酸)类药物可明显改善患者肝功能,抑制肝纤维化,提高临床总有效率,且不良反应少、耐受性较好;在临床上LWWL可能具有潜在的抑制肝纤维化的作用。第二部分六味五灵片抗胆管结扎和四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的药效评价及作用机制研究目的:研究LWWL抗BDL和CCl4诱导的模型大鼠肝纤维化的药理作用,并进一步探讨其可能的作用机制。方法:(1)采用BDL诱导的胆汁淤积型大鼠肝纤维化模型。大鼠随机分为假手术组(Control),BDL模型组,秋水仙碱组(BDL+Colchicine 0.0002g/kg),LWWL低、中、高剂量组(BDL+LWWL 0.4 g/kg,1.6 g/kg,6.4 g/kg)。除假手术组开腹后剥离胆总管后缝合,其余各组均开腹剥离胆总管双重结扎后缝合,术后第四天开始分别给药至第21天处死,取血取肝。采用HE染色法和天狼星红染色法(sirius red staining)观察肝组织病理学变化;比色法检测血清中丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST),碱水解法检测肝组织羟脯胺酸(hydroxyproline,Hy P);免疫组化法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原(collagen type I,Collagen type I)和核转录因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)p65表达;ELISA法检测血清中转化生长因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的水平;实时定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肝组织中α-SMA(Acta2)、Collagen I、TGF-β1、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血管内皮生长因子(endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)、基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP2)、Smad3、TNF-α、白介素-6(interleukin 6,IL-6)和白介素-1β(IL-1β)m RNA的表达;Western blot免疫印迹法检测肝组织α-SMA、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂(bone morphogenic protein and activin membrane-bound inhibitor,Bambi)、Smad3、Smad2/3、Smad7、p-Smad3、IκBα、p-IκBα及NF-κB p65蛋白的表达。(2)采用CCl4诱导化学性损伤的大鼠肝纤维化模型。SD大鼠随机分为橄榄油溶剂对照组,CCl4模型组,秋水仙碱组(CCl4+Colchicine 0.0002g/kg),LWWL低、中、高剂量组(CCl4+LWWL 0.4 g/kg,1.6 g/kg,6.4 g/kg),以CCl4和橄榄油1:1腹腔注射2 m L/kg造模,每周2次,造模8周后开始给予药物治疗,第12周处死,取血取肝。药效学指标检测同上。结果:(1)LWWL可有效地改善大鼠肝功能,抑制大鼠肝组织胶原纤维的生成。主要表现为LWWL可剂量依赖性地减少大鼠肝组织小胆管增生,减少炎性细胞浸润及纤维间隔的产生,明显保护肝细胞损伤,降低肝组织Hy P含量,此外还可改善BDL导致的大鼠肝脏重量的增加。(2)LWWL可抑制HSC的激活、增殖及趋化。主要表现为LWWL可显著地减少HSC活化表型α-SMA、Collagen I的表达,同时抑制促进HSC增殖和趋化的促纤维化生长因子PDGF和VEGF的表达。(3)LWWL通过调节MMPs及其特异性地抑制剂TIMPs,抑制病理性基质降解,加速异常增生的ECM的降解。主要表现为LWWL上调促进ECM降解的MMP13的表达,下调与ECM生成呈正相关的MMP2、TIMP1、TIMP2的表达。(4)LWWL可抑制TGF-β/Smad信号通路的转录调控。主要表现为LWWL可下调TGF-β1、Smad3、Smad2/3及p-Smad3的蛋白表达,上调Bambi、Smad7的蛋白表达。(5)LWWL可抑制NF-κB信号通路的基因转录。主要表现为LWWL可减少IκB-α蛋白磷酸化,使其降解减少,还可剂量依赖性地减少NF-κB p65的核转录,同时使NF-κB p65蛋白表达降低。此外,LWWL可剂量依赖性地降低NF-κB调控的炎症因子TFN-α、IL-6、IL-1β的表达。结论:LWWL能够有效地阻断和抑制BDL和CCl4诱导的大鼠肝纤维化的进展,其作用机制可能通过负调控TGF-β/Smad和NF-κB信号通路的传导和转录激活,从而减轻肝脏炎症反应,抑制HSC的激活、增殖及持续活化,促进ECM的降解,最终延缓、阻断甚至逆转肝纤维化的发展。以期为LWWL二次开发扩大其治疗肝纤维化的临床适应症提供了参考依据。