研究目的冷冻消融治疗在美国已成为局限期前列腺癌的一线治疗方法之一,转移性前列腺癌的局部治疗目前是一研究热点,备受关注。在冷冻消融治疗过程中,在最大限度消灭肿瘤的同时又要保护正常组织,很难保证所有癌组织都能达到致死温度,而是形成亚致死区(sublethal district)。冷冻消融后残存肿瘤细胞及肿瘤微环境与肿瘤的复发、转移密切相关。TGF-β与肿瘤的侵袭、转移、上皮间质转化以及肿瘤免疫等关系密切,我们前期研究发现,冷冻消融后血浆TGF-β发生变化,提示其在前列腺癌微环境中可能发挥一定作用。为此,本研究体外实验模拟冷冻后不同微环境中细胞状态,在细胞水平探讨冷冻对CWR-22RV1前列腺癌细胞系中TGF-β1的释放变化、细胞内TGF-β1及smads蛋白表达水平的影响,并在此基础上进一步探讨TGF-β阻断对冷冻后前列腺癌细胞侵袭、迁移力影响。研究内容TGF-β与肿瘤的侵袭、转移、上皮间质转化以及肿瘤免疫等关系密切,本实验模拟前列腺癌冷冻消融治疗后亚致死细胞对不同微环境的反应,探讨冷冻后亚致死细胞TGF-β的释放变化以及冷冻后瘤体内细胞TGF-β1及下游信号因子如smad2、smad3、smad4蛋白表达水平变化,同时探讨冷冻与TGF-β中和抗体对冷冻后前列腺癌细胞侵袭、迁移的影响。研究方法在本实验中,将细胞分为A,B,C,D四组。A组为未处理细胞,为对照组细胞。B组为实验组,经-80℃冻融(-80℃环境中冷冻7分钟)处理,模拟亚致死细胞。C组为实验组,未处理前列腺癌细胞培养液中加入坏死液(将前列腺癌细胞悬液放入液氮罐中冷冻4分钟,37℃复温后离心取上清,得到坏死液)。D组为实验组,为亚致死细胞的培养液中加入坏死液。流式细胞术检测细胞凋亡变化,酶联免疫吸附试验测定对照组及实验组细胞培养5小时、10小时、20小时、36小时、48小时上清液中TGF-β1浓度,研究各组TGF-β1的释放变化;采用蛋白质免疫印迹法测定细胞培养10小时四组细胞内TGF-β1、smad2、smad3、smad4蛋白的表达水平,探讨冷冻后TGF-β1、smad2、smad3、smad4蛋白表达水平变化;同时Transwell实验中增加E组(在D组基础上添加TGF-β中和抗体)检测冷冻与TGF-β阻断对前列腺癌细胞侵袭、迁移的影响。研究结果1.实验组B组细胞凋亡率较对照组A组增加(21.83±1.03 vs 11.2±1.57,P<0.05),实验组D组细胞凋亡率较实验组B组增加(29.50±0.52 vs 21.83±1.03,P<0.05)。2.实验组与对照组细胞上清液中TGF-β1浓度的时间变化趋势大致一致:上清液中TGF-β1浓度从5小时到36小时处于持续上升趋势,36小时达高峰之后下降。细胞释放的TGF-β1浓度实验组D组高于对照组A组,实验组B组低于对照组A组(P<0.05)。3.细胞培养10小时细胞内TGF-β1、smad2、smad3、smad4蛋白表达水平:实验组D组TGF-β1、smad2、smad3、smad4表达水平高于对照组A组,实验组B组TGF-β1、smad2、smad3、smad4表达水平低于对照组A组。4.Transwell侵袭实验的结果显示A组、B组、C组、D组、E组的穿膜细胞数为:89±1.2 vs 65±2.8 vs 115±4.6 vs 132±3.1 vs 48±4.7,P<0.05。Transwell迁移实验结果显示A组、B组、C组、D组、E组的穿孔细胞数为100±3.2 vs 60±4.2 vs 126±3.8 vs 158±3.3vs 30±5.1,P<0.05。侵袭及迁移力实验组D组高于对照组A组。实验组B组侵袭及迁移力低于对照组A组,而实验组E组的侵袭、迁移力最低。结论本实验模拟了前列腺癌冷冻消融治疗后亚致死细胞对不同微环境的反应,细胞培养结果显示:亚致死细胞凋亡率增加,加入坏死液后亚致死细胞凋亡更加明显。加入坏死液后亚致死细胞分泌TGF-β1较对照前列腺癌细胞增多,细胞内TGF-β1、smad2、smad3、smad4蛋白表达水平增高,细胞侵袭迁移能力增强。TGF-β中和抗体可抑制亚致死细胞侵袭、迁移力。