研究背景与研究目的食管癌是常见的恶性肿瘤，世界范围内食管癌发病率居第8位，死亡率居第6位。食管癌的发病率具有明显地区差异性。我国为食管癌高发区之一，食管癌发病和死亡人数均占全球的一半以上。西方国家食管癌以Barret’s食管引起的腺癌为主，而我国绝大多数为鳞癌。目前食管癌的诊治水平虽有所提高，但初诊时已有约80%患者为中晚期，即使术后食管癌患者的复发率高达40%。肿瘤复发和转移是食管癌预后差的主要原因之一。因此，对食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）转移的分子机制进行深入研究并积极寻找具有潜在临床应用价值的靶标具有重要意义，可能为治疗ESCC提供新靶点、新策略。肿瘤转移为肿瘤细胞脱离原发部位，经由脉管系统或直接侵袭到达身体其他部位，定植并最终形成新的肿瘤病灶的复杂过程，受多种促转移基因和转移抑制基因的调控。寻找与ESCC转移有关的基因，探讨其促进ESCC转移的机制，进而阻断或逆转其促进转移的作用，可能会在ESCC治疗中发挥重要作用。肿瘤转移是肿瘤细胞、宿主细胞和组织微环境之间相互作用的序贯连续过程。肿瘤细胞丧失细胞与细胞间连接并获得移动能力，侵入邻近组织是肿瘤转移的前提。越来越多的研究表明上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤转移，尤其是肿瘤细胞侵袭时单个细胞从肿瘤组织上脱离的过程中起着重要作用。EMT是指上皮细胞失去分化特征，表现为细胞极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，伴随着细胞迁移和运动能力的增强，并获得了间质细胞特征，如迁移、侵袭及对凋亡刺激的耐受等。同时E-cadherin等上皮细胞表型丧失，而获得间质表型（如N-cadherin、vimentin、fibronectin等）。TGF-β（The transforming growth factor-β转化生长因子β）是EMT的重要启动因子，在细胞的生长、凋亡、分化、迁徙中具有重要作用，在胚胎发育及成人机体的稳态中发挥重要作用。TGF-β在肿瘤性疾病中具有双重作用。在肿瘤发生初期，TGF-β通过抑制生长、促进凋亡、促进细胞分化、抑制有利于肿瘤发生的炎症来抑制肿瘤的发生。然而，在进展期肿瘤中，TGF-β的表达量升高，促进肿瘤的进展及转移，其中一个重要的机制即是促进细胞EMT的进程，使细胞变得更有侵袭性而更易形成转移灶。但在食管癌中TGF-β调控EMT的机制还有待进一步研究。LMO1为一种小分子的锌指蛋白，主要由2个呈直线排列的LIM结构域组成，含有很少的其他序列，通常通过与其他蛋白结合形成转录复合物或与其他蛋白转录复合物结合破坏其原有的结构而发挥作用，在胚胎发育、细胞凋亡、肿瘤发生及转移中有重要作用。有研究发现LMO1在T淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblastic leukemia ALL）、T细胞急性淋巴细胞白血病细胞及前体T淋巴母细胞白血病的发生中发挥重要作用。全基因组SNP芯片联合全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）分析发现在12.4%的儿童神经母细胞瘤患者中存在LMO1的过表达，且LMO1的高表达与肿瘤的进展及不良预后呈正相关。研究表明，多个LIM家族的蛋白均参与了EMT调控，而关于LMO家族成员调控EMT的报道很少，LMO家族的成员包括LMO1，LMO2，LMO3和LMO4，有研究显示在血管内皮细胞中下调LMO2表达水平可使E-cadherin表达下调，另有研究表明LMO4可调节TGF-β引起的EMT。LMO1是否也参与了EMT的调节还尚不明确。但有研究显示LMO1可以与GATA3结合发挥作用，而GATA3在E-cadherin的调节中发挥重要作用。提示LMO1可能也参与了EMT的调控。此外有报道，LMO1可通过上调GSDM来介导TGF-β刺激引起的胃粘膜上皮细胞的凋亡。LMO1是否也参与了TGF-β介导的EMT及肿瘤转移的调控还有待进一步研究。因此，本文将研究LMO1在ESCC转移及EMT中的作用，阐明TGF-β在ESCC中通过促进LMO1表达启动EMT的分子机制，探寻LMO1做为ESCC治疗靶标的可能性。研究方法1)利用免疫组织化学技术（Immunohistochemistry IHC）检测了LMO1蛋白在138例食管癌组织及其癌旁组织中的表达，并比较了LMO1在肿瘤组织及癌旁组织中表达水平的差异。2)利用慢病毒体系过表达或干扰LMO1的表达。通过细胞划痕修复实验、软琼脂克隆形成、transwell细胞迁徙实验、Matrigel细胞侵袭实验、KYSE150和TE11细胞的自发转移瘤模型及KYSE30尾静脉注射肺转移模型在体内及体外检测改变LMO1表达水平后对ESCC细胞转移能力的影响。3)通过real-time PCR、Western Blotting及免疫细胞荧光检测改变LMO1表达水平后ESCC细胞EMT标记物（E-cadherin及N-cadherin）的变化，通过IHC检测裸鼠皮下肿瘤组织中上述EMT标志物的变化，研究LMO1是否通过改变EMT进程影响ESCC细胞的转移。4) TGF-β处理细胞后通过real-time PCR及Western Blotting检测其EMT标志物及LMO1表达水平的变化，验证TGF-β刺激引起的EMT是否伴随着LMO1表达水平的改变。利用shRNA技术干扰掉LMO1的表达，然后用TGF-β刺激细胞，通过real-time PCR检测细胞EMT标志物的变化，通过transwell细胞迁徙实验检测细胞迁徙能力的变化，探讨LMO1在TGF-β介导的EMT及细胞迁移能力变化中的作用。5)利用siRNA技术下调TGF-β下游信号通路关键信号分子的表达，寻找TGF-β调控LMO1表达的信号通路。实验结果：1) LMO1在ESCC中表达上调：LMO1在肿瘤组织及癌旁组织中的表达均定位于细胞核。138例ESCC患者肿瘤组织及癌旁组织中LMO1的阳性表达率分别为86.9%（120/138）vs50.7%（70/138），其在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，差异极显著(p<0.001)。2) LMO1促进ESCC侵袭和转移：过表达LMO1表达水平后KYSE30及KYSE150的划痕修复能力提高，细胞迁徙能力分别上升至3.1倍及2.9倍，细胞侵袭能力分别增强为1.5及2.7倍。在TE11细胞中下调LMO1的表达后，划痕修复能力下降，LV-shLMO1-a及LV-shLMO1-b组细胞迁徙能力分别下降至31%及19%，侵袭能力分别降低至22%及19%。体内实验显示KYSE30及KYSE150过表达LMO1后形成肺转移的能力分别上升至3.8倍及4.98倍。在TE11细胞中下调LMO1的表达后，LV-shLMO1-a及LV-shLMO1-b组细胞自发形成肺转移瘤的能力分别下降至51.6%及32.6%，自发形成肝转移瘤的能力分别下降至37.2%及23.7%。3) LMO1促进ESCC的EMT进程：在KYSE30细胞中过表达LMO1后细胞由典型的鹅卵石样变为纺锤体样，同时伴随着E-cadherin的下降及N-cadherin的上调，骨架蛋白发生重构以利于细胞迁移。下调TE11细胞中LMO1的表达后细胞由长梭形变为互相紧密接触的多角形或椭圆形，同时伴随着E-cadherin的明显上调及N-cadhein的明显下降。在KYSE30细胞中过表达LMO1的表达后其在体内形成的肿瘤组织E-cadherin的表达明显下降甚至消失，同时伴随着EMT形态的变化。4) TGF-β促进LMO1表达，且沉默LMO1阻滞TGF-β诱导的EMT进程：TGF-β刺激多种细胞系均发生明显的EMT改变，同时伴随着LMO1的表达升高，且LMO1的上调水平随着TGF-β刺激时间及剂量的增加而上升。下调LMO1的表达使TGF-β刺激引起的E-cadherin下调及N-cadherin上升水平均得到一定程度恢复，使细胞迁移能力的增强受到抑制。5) TGF-β促进LMO1表达的分子机制的研究：通过siRNA下调Smad2、Smad3及Smad4的表达均能很大程度上抑制TGF-β刺激引起的LMO1表达上调及EMT进程，证实TGF-β是通过Smad依赖的方式来激活LMO1转录的。结论我们发现LMO1在ESCC肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，LMO1在体内及体外均能明显促进ESCC的转移能力，说明LMO1在促进ESCC转移方面发挥重要作用。阐明LMO1通过促进EMT进程促进ESCC的转移，首次证明LMO家族成员可促使肿瘤细胞发生EMT。在多种肿瘤细胞中发现LMO1介导TGF-β刺激产生的EMT，并阐明TGF-β通过Smads信号通路调节LMO1的表达。综上，我们的研究表明，TGF-β刺激引起的LMO1上调在促进ESCC发生EMT及转移方面发挥重要作用，为食管癌治疗的潜在靶标。