反刍动物甲烷排放是加剧温室效应的重要因子,而且反刍动物摄入的2～12%饲料总能会转化为甲烷而损失掉,因此寻求降低反刍动物瘤胃甲烷排放的调控措施具有重要的学术意义和现实意义。反刍兽甲烷短杆菌是反刍动物瘤胃利用H₂还原CO₂生成CH₄的优势产甲烷菌。辅酶F₄₂₀又是H₂还原CO₂生成CH₄途径中的关键辅酶,CofD酶是F₄₂₀生物合成的重要作用酶,对F₄₂₀合成具有重要意义。本研究拟从肉牛瘤胃中分离出优势产甲烷菌反刍兽甲烷短杆菌,采用基因敲除手段研究cofD基因敲除对瘤胃反刍兽甲烷短杆菌辅酶F₄₂₀合成量和甲烷生成的影响。试验一、反刍兽甲烷短杆菌的分离鉴定及培养本实验采用系列稀释滚管挑单菌落的亨盖特厌氧技术,利用优化的BRN（Bryant and RobisonNutrite）培养基,对宣汉黄牛的瘤胃液样本进行多次系列稀释、富集、纯化培养,分离、筛选出纯的产甲烷菌,并对分离得到的菌株进行鉴定。结果表明:（1）分离纯化出的产甲烷菌光学显微镜下呈平滑短杆状,直径0.7μm左右,长为0.8～1.8 μm,单个存在或由2-4个菌体形成短链,在荧光显微镜下呈现蓝绿荧光。（2）用甲烷菌16S rDNA基因的通用引物（84F-1340R）来扩增其DNA,得到了与目的片段长度、特异性一致的阳性条带。（3）对扩增产物进行克隆测序,发现所测得的序列与NCBI库中反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）16S rDNA 序列（Accession:AY196666）相似性高达99%。（4）采用Clustal进行比对,通过Mega软件进行UPGMA分析构建系统发育树,分离得到的产甲烷菌与Methanobrevibacter ruminantium M1的亲缘关系是100%。（5）对分离得到的反刍兽甲烷短杆菌进行培养结果表明,随着菌体的增殖甲烷产量逐渐增加,氢气消耗量也逐渐增加,该菌能够有效利用H₂生成CH₄。试验二、反刍兽甲烷短杆菌的cofD基因敲除体的构建及验证以分离得到的反刍兽甲烷短杆菌为研究对象,通过敲除辅酶F₄₂₀合成所需的关键酶的编码基因cofD,采用插入失活的方法对cofD基因进行敲除,构建基因敲除载体pUC18-cofD-tet,然后电转化反刍兽甲烷短杆菌感受态细菌。结果表明:筛选出的cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌突变株的cofD基因表达量和CofD酶蛋白表达量均显著低于野生型（P<0.05）,表明cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌菌株构建成功。试验三、cofD基因敲除型与野生型反刍兽甲烷短杆菌辅酶 F₄₂₀合成量和甲烷生成量的比较扩大培养比较cqfD基因敲除型和野生型的反兽甲烷短杆菌的生长曲线,并分别在培养12,24,36,48和96h时终止培养,比较辅酶F₄₂₀含量和甲烷产量的差异。结果表明:（1）cofD基因敲除后反刍兽甲烷短杆菌对数增长期（16h）低于野生型反刍兽甲烷短杆菌对数增长期（24h）,cofD基因敲除后菌体的增殖幅度显著降低。野生型反刍兽甲烷短杆菌的最大菌体量和最大比生长速率均显著高于cofD基因敲除型（P<0.01）,野生型反刍兽甲烷短杆菌的最大菌体量是cofD基因敲除型的2倍。（2）cofD基因敲除后反刍兽甲烷短杆菌辅酶F₄₂₀的含量显著降低,在36h、48h、96h,单位菌体量的辅酶F₄₂₀含量分别降低了 29%、59%、30%（P<0.01）;（3）cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌的最大耗H₂量和最大CH₄生成量分别是野生型反刍兽甲烷短杆菌的14%和2%。以上结果表明,cofD基因敲除降低了反刍兽甲烷短杆菌辅酶F₄₂₀合成量和甲烷生成量。综上所述,本试验成功分离培养了瘤胃反刍兽短甲烷杆菌,并构建了反刍兽甲烷短杆菌的cofD基因敲除体。cofD基因敲除后降低了反刍兽甲烷短杆菌的CofD酶表达量,降低了辅酶F₄₂₀的合成量,降低了反刍兽甲烷短杆菌的生长增殖能力,最终降低了其利用H₂生成CH₄的能力。