古紫质-4(aR4)是新近发现的古生菌Halobacterium speciesxz515菌红膜上的唯一的光敏视黄醛蛋白,和细菌视紫红质(bR)具有相似的质子泵功能,但在中性pH条件下,两者的质子释放和摄取顺序相反。深入研究质子供体天冬氨酸97(Aspartic acid 97,D97)对蛋白光循环、质子泵功能和能量转化效率影响的作用机理,并从分子水平上揭示aR4质子释放和摄取时序反转内在原因具有重大的指导意义。研究工作采用基因定点突变技术,在宿主细胞Halobacterium speciesL33中成功表达出了 aR4的单突变体D97N,以及相对应的bR单突变体D96N。采用固体核磁共振技术、紫外-可见吸收光谱、闪光动力学光谱和低温透射红外光谱等谱学手段,对蛋白视黄醛键合区、光反应中间态、质子泵功能以及ATP生成率等进行了原生膜环境条件下的原位表征。闪光动力学光谱测定结果表明,D97突变可造成aR4的M态衰减时间延长至秒级,并使蛋白丧失质子泵功能,而对应的D96N突变则造成了 bR的M态衰减时间延长和O态的消失,但是蛋白仍具有质子泵功能。固体核磁共振、紫外-可见光谱、蛋白聚集状态及其ATP生成率等数据显示,不论是aR4中的D97还是bR中的D96,都距视黄醛发色团有10A之远,突变没有对视黄醛键合区产生显著的影响,但对质子泵功能和蛋白的三聚结构产生了一定的影响,使得突变体菌株ATP的生成率下降了 50%。低温透射红外光谱测定结果表明,与bR中的D85不同,aR4中的D86质子化过程提前到了L态,并一直维持到了N态。所有研究结果揭示,同为质子供体的D97和D96在aR4和bR光循环中发挥着不同的作用,表明aR4与bR存在着不同的光循环中间态,而这与二者质子释放和摄取时序反转有着直接的对应关系。