乳腺癌是影响全世界妇女健康的主要恶性肿瘤,发病率位居女性恶性肿瘤之首,针对乳腺癌的研究具有巨大的社会学及医学意义。目前,乳腺癌诊治常用的标志物有限,更多有意义的标志物需要被筛选出来。传统用于标志物筛选的实体瘤组织样本中,除了癌细胞以外还存在正常细胞等干扰“杂质”,影响了标志物筛选结果,许多患者也无法随时获得其组织样本,实施动态监测与筛选。由于肿瘤细胞生长迅速,细胞之间的黏合力较低,大量肿瘤细胞会发生脱落而进入循环血液成为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）。与实体瘤组织相比,单个CTC具有一个细胞的完整遗传信息,没有其他细胞或核酸的干扰,通过多次捕获单个CTC进行分析,可以实时动态地筛选出反映肿瘤变化的生物标志物。因此,建立一种基于单个CTC的标志物筛选方法平台对肿瘤标志物筛选十分必要。然而基于单个CTC的标志物筛选平台需攻克以下关键技术:（1）高效的CTC捕获方法,能高灵敏地获得病人CTC;（2）无损的CTC鉴定方法,可对捕获的细胞进行鉴定而不影响单个细胞内RNA的检测;（3）单细胞基因表达谱的测定方法,可对单细胞中基因表达量进行分析,从而筛选出分子标志物。首先,为了从病人的全血中调取出CTCs,我们利用基于免疫磁珠阳性富集技术结合荧光细胞化学染色方法,建立了检测乳腺癌患者外周静脉血中循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。该方法对健康和良性乳腺疾病患者的检出率均为0%,乳腺癌患者总体检出率44%。并且,本论文证明CTCs数目与乳腺癌患者的年龄、ER、PR表达和病理分型有显著相关性,还对新辅助化疗疗效有很好的预测评价作用,同时发现了先切除肿瘤后清扫腋窝淋巴结的手术方式可能会促进肿瘤细胞的扩散。其次,为了得到可用于RNA检测的单细胞CTC样本,我们针对细胞中mRNA不稳定易受操作影响而降解的特点,系统考察了 CTCs捕获、固定、破膜、染色和储存等操作条件对单细胞mRNA的影响,发现在操作过程中RNA酶抑制剂可以保护单细胞mRNA不被降解,并且所有的操作都应该在低温环境下进行;而被4%多聚甲醛固定液或0.1%Triton X-100通透液处理过的细胞无法进行正常的单细胞mRNA反转录;为了更容易挑选到活性好的单细胞CTC,增加了钙黄绿素染色步骤,大大提高了成功率;取得的单细胞CTC应存在-80℃不超过一个月。本论文的研究提出了可靠、实用的单细胞CTC基因表达量检测样本准备方法,为使用单细胞检测基因表达量奠定了基础。接着,为了使用高通量测序方法筛选标志物,将pg级的mRNA放大扩增到ng级,我们建立了单细胞CTC的cDNA文库构建技术。通过对文献报道的cDNA文库构建方法的改进,引入ddATP控制polyA的加尾长度,大大提高了 cDNA生成的效率,构建了“beads-dd-seq单细胞cDNA文库构建方法”。另外,针对实际临床样本单细胞CTC的RNA含量少的特点,将原有技术的PCR扩增次数增加至3次,增加文库总DNA的含量,从而满足高通量测序实验的要求。最后,收集了一批首发淋巴结转移和首发淋巴结未转移患者样本。通过对组织水平转录组的标志物筛查,我们初步发现了二组之间有198个潜在的差异表达基因;通过将单细胞CTC样本筛选结果与组织样本的筛选结果对比,我们发现了 OBSCN、EPPK1和FLJ27365三个基因,这三个基因在首发淋巴结未转移患者的单细胞CTC样本中显著低表达,而在首发淋巴结转移的患者组织中高表达,因此,这三个基因可能是潜在的标志物。由于样本的数量有限,目前标志物筛选结果不够精准,并且缺乏验证,随着后续样本结果的加入,相信可以筛选到明确的标志物。考虑到通过上述平台筛选到的标志物需要进一步验证,表达量差异可能来源于DNA水平上的拷贝数变异,并可能表现为蛋白水平上的功能性缺失,我们分别建立了两种方法用于标志物验证。首先,我们建立了一种基于数字化PCR的高灵敏、无创的检测方法,对来源于DNA水平上的拷贝数变异进行验证。考虑到无创检测胎儿游离DNA拷贝数变异与无创检测肿瘤游离DNA拷贝数变异的方法学相似性,我们以唐氏综合征为应用对象,建立了一种准确、无创的唐氏综合征产前诊断方法SD-Digital PCR 技术。通过分析胎儿 DNA 含量为 100%、50%、25%、20%、15%、10%、3%和0%的模拟混合样本,确认了 SD-Digital PCR技术可以检测胎儿DNA含量低至10%的样本;通过分析12例正常人样本的检测数据,计算“片段重复”序列比例的阈值区间,我们测定了 3例唐氏综合征患者样本,所有21三体母血样本的染色体比例均位于阈值区间之外,且每个样本为21三体的可信度为99%以上;本方法检测一例样本耗时不足3小时,可显著缩短检测结果的等待时间,减缓孕妇及其家庭的心理负担;本方法检测成本不足200元,比大规模测序检测便宜,减轻孕妇及其家庭的经济压力。该方法并不局限于无创检测胎儿的染色体异常,也可用于检测肿瘤患者循环肿瘤DNA（ctDNA）中的拷贝数变异,为后续标志物的验证打下了基础。另外,我们构建了一种不依赖DNA序列识别的基因敲除工具酶,即结构介导核酸内切酶SGN。通过分析SGN切割不同序列的单链DNA靶标结果,确认了 SGN反应确实不受核酸靶标序列限制;通过对斑马鱼卵细胞外源基因和内源基因的敲除分析,确认了 SGN可以在体内作用,敲除的产物是大片段缺失片段;通过在体外模拟体内切割反应,推测了 SGN产生大片段缺失的可能原理。SGN是一种无序列限制的核酸内切酶,与ZFN、TALEN和Cas9不同,可以对任意靶标序列进行切割,在基因敲除领域有较大的应用前景,可以用于前期筛选到的分子标志物的蛋白水平功能性验证。本课题主要从方法学的角度,针对临床需求,分别构建了基于单细胞CTC转录组筛选分子标志物的方法、可用于拷贝数变异标志物验证的数字化PCR方法和可用于标志物功能性验证的基因敲除工具酶,并且利用这些方法,对临床样本进行了检测。