论文部分内容阅读
目的：通过构建p27kip1磷酸化位点突变质粒及对p-p27kip1蛋白在肝癌、癌周肝硬化、肝硬化、正常肝组织中的表达研究,探索p-p27kip1蛋白表达及定位改变与肝癌发生、发展之间的关系,探讨其在肝癌发生发展过程中的作用及机制。方法：第一部分质粒构建1.提取目的基因： (1)Pubmed Genebank查询检索,获得p27kip1的mRNA序列,并设计含酶切位点的引物；(2)应用Trizol法提取人正常肝细胞总mRNA; (3) RT-PCR进行目的基因p27kip1 (wt)的扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果； (4)p27kip1 (wt)基因调取产物测序及Blast检测； (5)目的基因p27kip1(wt) PCR产物回收,其A端与原核质粒表达载体pUCm-TT端连接； (6)细菌转化、筛选、扩增、质粒抽提、测序；(7)BglⅡ/SalⅠ双酶酶切pUCm-T-p27kip1(wt)及真核表达载体pIRES2-EGFP;(8) p27kip1(wt)连接真核载体pIRES2-EGFP,并将连接产物测序、做Blast检测。2.构建突变体真核表达质粒：(1)设计突变体引物； (2)根据定点突变试剂盒(MAN0013377 Phusion Site Directed Mutagenesis UG)提供的方法对pIRES2-EGFP-p27kip1(wt)进行基因定点突变；(3)细菌转化、筛选、质粒抽提、测序； (4)基因定点突变后测序及Blast验证。第二部分免疫组化选取昆明医科大学第一、第二附属医院及附属甘美医院病理科保存的肝癌、肝硬化及正常肝组织蜡块,切片HE染色。肝癌伴癌周肝硬化36例,肝硬化38例,对照组正常组18例,共92例。采用免疫组化方法检测在正常肝组织、肝硬化、癌周肝硬化及肝癌组织中p-p27kip1S10、T157、T187及T198蛋白的表达情况。结果：第一部分质粒构建1.目的基因(wt)在人正常肝细胞中提取及鉴定(1)人正常肝细胞总RNA提取产物的琼脂糖凝胶电泳显示,Trizol法提取的人正常肝细胞株(HL-7702)总RNA质量良好。(2)RT-PCR扩增的目的基因p27kip1(wt)1%糖凝胶电泳结果显示,检测到500bp特异性扩增条带。(3)测序结果Blast分析显示,所获目的基因与Genebank所公布的人p27kip1mRNA序列NM 004064.4中CDS (Coding sequence,编码序列)相同,无移码和突变,扩增出的目的基因为p27kip1(wt)编码序列。2. p27kiP1 (wt)-pIRES2-EGFP连接产物测序及Blast结果显示：插入pIRES2-EGFP载体的目的基因序列与Genebank所公布的相关序列NM 004064.4中编码序列相同,无突变和移码,为p27k’P1(wt)编码序列。3. BgⅢ/SalI双酶酶切pIRES2-EGF-p27kiP1 (muts)验证结果显示：8种pIRES2-EGF-P27kiP1 (muts)均产生5.3kb与600bp两条片段。4. p27kip1 (muts)突变产物测序及Blast结果显示：四个不同磷酸化位点磷酸化的p27kip1蛋白模拟形式真核表达质粒[pIRES2-EGFP-p27kiP1 (S10E)、 pIRES2-EGFP-P27kiP1 (T157E)、pIRES2-EGFP-p27kip1 (T187E)和pIRES2-EGFP-p27kiP1(T198E)].四个不同磷酸化位点去磷酸化的p27kip1蛋白模拟形式真核表达质粒[pIRES2-EGFP-p27kiP1 (S10A)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T157A)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T187A)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T198A)]除各自突变位点外,序列均与p27蛋白编码序列(NM 004064.4中CDS)相同。第二部分免疫组化1. p-p27kip1T157主要为胞核表达,其中肝癌组表达最强(阳性表达率71.50±16.63%,平均灰度值81.63±6.92)明显高于与癌周肝硬化组(阳性表达率20.10±20.68%,平均灰度值133.58±21.33)(p<0.001)及正常肝组(阳性表达率18.00±17.89%,平均灰度值128.29±20.34)(p<0.001)。癌周肝硬化组表达明显低于肝硬化组(阳性表达率58.57±13.45%,平均灰度值88.65±6.85)(p<0.001)。正常肝组的阳性率明显低于肝硬化组(p<0.001)。2. p-p27kiP1T187、p-p27kio1S10及p-p27kip1T198在肝细胞癌及癌周组织中均有表达,p-p27kip1T187、p-p27kiP1S10主要为胞浆表达,而p-p27kip1T198为胞核表达。结论：1.本实验从人正常肝细胞中提取p27kip1(wt)基因,成功构建了pIRES2-EGFP-p27kiP1 (wt)真核细胞表达质粒载体。并在其基础上体外成功构建了四个不同磷酸化位点磷酸化的p27kip1蛋白模拟形式真核表达质粒[pIRES2-EGFP-p27kiP1 (S10E)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T157E)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T187E)和pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T198E)];四个不同磷酸化位点去磷酸化的p27kip1蛋白模拟形式真核表达质粒[pIRES2-EGFP-p27kiP1 (S10A)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T157A). pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T187A)、pIRES2-EGFP-p27kiP1 (T198A)],可使被转染的细胞分别表现为p27kip1蛋白在S10、T157、T187、T198磷酸化位点的激活(E)和失活(A)特征。为后续实验做准备,为进一步研究p27kip1蛋白磷酸化在肝细胞癌中的作用提供重要实验基础。2. p-P27kiP1蛋白表达及定位改变与肝癌发生具有密切关系。p-p27kiP1T157癌周肝硬化与肝癌和不伴癌的肝硬化均不同,有待进一步深入研究。