研究背景及目的:观察卒中后不同时间点血管新生的动态变化及与其密切相关的调节因子如缺氧诱导因子、血管源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的表达变化，探索促进血管新生的新方法。 研究方法、结果、讨论:1卒中发作因素的临床研究收集1980年1月～1999年12月期间，在中山大学附属第一医院神经科住院资料完整符合标准的所有卒中病历，并将病例资料逐一进行筛选、整理后，将相关资料(包括发作诱因)摘录填表，输入方略结构化电子病历系统(简称：医案通)进行汇总。分析时将所需项目输出至excel表格，进一步整理归类后，用SPSS11.0统计软件中的方差分析和卡方检验进行统计学分析。 我们认为多数卒中的发生前存在多种致病诱因。某些因素如1周内的感冒、过劳及寒潮、饮食失调等诱发出一段短时间的机体内环境明显改变即卒中前状态。而某些因素如较长时间安静、突然用力、激动等即时因素则是引起卒中即时发作的促发因素。深入分析卒中前状态及促发因素将有助于开阔卒中研究的新视野，还提示我们除了积极治疗卒中的基础病变外，及早认识并解除或缓解卒中前状态和/或促发因素是十分必要和关键的，只有这样才能采取相应的预防措施，实现真正意义上的个体化预防。 2预防卒中发作的实验性研究 大量流行病学调查和临床资料显示卒中的发作与气象有较大关系，在气温变化激烈的冬春季节明显多发，特别在温差变化较大的寒潮更易成批发生，此也为我们以前的动物实验及此次的临床调查所证实。如上所述，我们所探索设计的人工智能寒潮箱能够较好的模拟自然寒潮的发生，获得较好的效果。而且由于有统一的温差和昼夜的周期性变化，又能很好的使温度、湿度等参数标准化，具有良好的可控性、重复性和科学性，便于实验研究。此外该模型在操作方面也简单、易行，结果统一、可靠，避免了线栓法MCA0等动物模型的学习操作时间，大大缩短了实验时间。更值得注意的是，该模型可用于卒中的预防性研究，因而具有十分重要的临床意义。 脑的微循环在生理状态下为脑组织提供营养代谢，在脑的损伤机制中又具有核心作用，由此可见，研究卒中微循环的改变就显得尤为必要，针对微循环的治疗也成为最重要的方法。为此我们特别观察了病理切片下阿司匹林、丁苯酞对脑微循环结构形态的影响，油镜下的观察结果显示阿司匹林组和丁苯酞治疗组的微血管结构形态相对完整。另外，采用能较好的反应微循环的状态的方法，即用FITC标记的右旋糖苷直接静脉注射，只存在于功能良好并且通畅的血管中，而血管内皮特异性标志物vwf免疫组化则显示所有血管。本组实验结果表明阿司匹林和丁苯酞能增加脑组织微血管的数量，在同一部位面积一样相同时间内的微血管显示较对照组增多。此外我们也做了阿司匹林和丁苯酞的微血管的免疫组化，计数了vwf阳性血管数，结果显示在200倍显微镜下vwf的阳性血管平均数目比荧光标记的血管数多出45.63、46.69个。上述结果表明高血压大鼠的脑组织上存在有一些功能不良如不通畅或甚至关闭的血管。正常血压大鼠的大脑中动脉阻塞模型中，也会出现明显的微循环受损。综上，可以初步认为丁苯酞可能是通过改善微循环、阿司匹林通过减少血小板聚集减轻微循环恶化从而起作用的。 目前，可广泛用于预防的药物尚且不多，此次实验的结果表明，阿司匹林和丁苯酞均能通过减缓或消除卒中前状态而减少原发性卒中的发生率，降低卒中引起的脑损伤，而减轻微循环的损坏可能是其机制之一，至于其他方面的作用机制还有待于进一步研究证明。 3脑微循环在缺血性卒中防治作用的研究3.1RHRSP血管结构改变的观察取3只正常SD大鼠和7只RHRSP；首先一般性的观察高血压对大血管的影响；分离不同部位的较大血管如主动脉、大脑中动脉等，制成石蜡切片后用H.E染色观察其结构变化，免疫组化法进一步观察其α-smoothmuscleactin、AT1、AT2、CD68、Ki67表达变化。其次观察高血压对微循环的影响；用电镜观察RHRSP大脑中动脉供血区的微血管结构改变，继而用免疫组化法进一步检测微血管纤维蛋白的沉积情况。 HE染色显示在RHRSP的较大动脉都有不同程度的管壁增厚及管腔狭窄，免疫组化进一步揭示存在有巨噬细胞特异性抗体、细胞增生的特异性抗体PCNA及ACEⅡ的特异性受体AT1、AT2的广泛表达，说明RHRSP血管壁的结构重塑的机制可能与ACE导致的炎性细胞浸润、平滑肌细胞肥大、增生有关。在电镜下也可以见到RHRSP皮质少量微血管存在管腔狭窄、微血栓形成等微循环障碍的轻度表现，并且免疫组化法证明有纤维蛋白的少量沉积。 我们的实验结果表明，RHRSP在做完双肾双夹手术2个月后，收缩压已经上升到200mmHg以上，此时血管的生理功能已经有所改变但还没有3个月时变的那么差(数据尚未公开)，其结构基础即是出现了血管结构的重塑。而有文献报道，经过降血压治疗可以逆转血管结构的改变。肾素—血管紧张素系统应是建立RHRSP的理论基础，我们在多处血管和组织上检出有ACE受体的存在，而ACE本身具有致炎、促进血管平滑肌增生等作用。由此考虑ACE是造成血管重塑的重要原因。另外在较大血管存在病理损伤的同时，也发现RHRSP亦存在有多种形式的微循环受损如纤维蛋白沉积、内皮损伤等，这些微循环的损伤也极有可能是微梗塞形成的基础。因此及时降压保护微循环对卒中的预防也是十分重要的。 3.2脑梗塞后RHRSP微循环的障碍建立RHRSP模型，光化学法建立大脑中动脉闭塞模型，在闭塞后24h(n=5)，用Western-blot进行Fibrin定量分析，并留取其中3只大鼠的部分脑组织在电镜下观察半暗带区的微循环变化。另取一组(n=6)24h点的大鼠脑组织切片免疫组化法观察纤维蛋白的沉积。 RHRSP的光化学MCAO模型在MCA024h后，在缺血半暗带区可以看到较多的微血栓沉积，内皮细胞肿胀、凋亡、基膜融解等微循环严重受损的表现，并且用免疫组化法和Western-blot进一步证明存在纤维蛋白的较多沉积。 上述实验表明，在脑梗塞后微循环障碍更加明显，出现了更多的微血栓、白细胞沉积、基膜断裂等现象，而且纤维蛋白也有了更多的沉积。因此卒中后在卒中的治疗中改善微循环也是十分重要的。 3.3卒中后血管新生的实验研究建立RHRSP模型，光化学法建立大脑中动脉闭塞模型，在梗塞后3h(n=6)、6h(n=6)、12h(n=6)、24h(n=6)和48h(n=6)杀鼠取脑，将脑组织制成石蜡切片后，用标记血管内皮细胞的特异性抗体CD31和标记细胞增殖的抗体PCNA进行免疫双标，在共聚焦或者荧光显微镜下观察新生血管的增殖情况，并用免疫组化法分别检测HIF-1α、VEGF、bFGF的在不同时间点的表达变化。 在RHRSP光化学大脑中动脉闭塞模型后，6h即可以看到有新生血管出现，并随着时间的延长而逐渐增多，在48h时达高峰，而且发现在患侧脑室旁，有较多新生细胞和内皮细胞双标的细胞出现。与血管新生紧密相关的HIF-1α、VEGF、bFGF与假手术组相比均有不同程度的表达升高。已知脑梗塞后梗塞灶周围存在一个低血流的半暗带区，而HIF-1α是缺氧的敏感指标，它的高表达会导致下游的靶基因VEGF、bFGF等的高表达，而且后两种蛋白是促进血管生长的重要因子，他们的高表达促进了血管早期的生成，通过促进VEGF、bFGF的表达提高也是促进血管新生的重要方法之一。 结论：1对20年卒中住院患者进行大样本系统回顾，系统总结卒中发作的促发因素；首次用大量病例在临床证实卒中前状态及促发因素的存在，加强对卒中前状态和促发因素的行为学控制有可能较大幅度减少卒中的发生。 2用人工寒潮诱发的RHRSP卒中有关实验结果，也证实了卒中前状态在动物中的存在，显示人工寒潮诱发RHRSP可成为卒中发作预防研究的一个良好动物实验模型。 3应用药物对寒潮诱发的卒中进行了干预性实验，首次证明缓解卒中前状态中的易血栓状态，可以减少卒中尤其是脑梗塞的发作，证实了卒中预防的广泛前景。4较为系统的论证了微循环在卒中发作前、发作中的重要性，用动物实验进一步证实微循环障碍在预防中的作用。 5采用RHRSP对卒中早期血管的新生进行了较为系统的研究，证明MCAO后6h即有血管新生，并且可能与脑室周围神经干细胞的增殖有关。提高卒中后VEGF、bFGF表达，可能成为促进卒中后血管的新生、卒中康复治疗的一个重要方向。