背景着色芽生菌病(Chromoblastomycosis,CBM)是一种由暗色真菌引起皮肤和皮下组织的慢性炎症性疾病。主要分布在热带和亚热带地区。CBM的致病菌以着色霉属(Fonsecaea spp.)和枝孢瓶霉属(Chladophialophora spp.)为主。着色霉属中裴氏着色霉(Fonsecaea pedrosoi)、Fonsecaea monophora、Fonsecaea nubica和Fonsecaea pugnacius均是CBM的致病菌。Najafzadeh等人在2010年首次报道了F.nubica,其在形态学上与裴氏着色霉和F.monophora类似,难以区分,通过测定AFLP分子标记技术、转录间隔区序列(Internal transcribed spacers,ITS)、部分细胞分裂周期(Partial beta-tubulin,CDC42)、β-微管蛋白(Partial beta-tubulin,BT2)和肌动蛋白(Actin,ACT1),将F.nubica作为新的物种从裴氏着色霉中分离出来。目前既往文献中已报道40多株F.nubica,这些菌株主要从巴西、中国、非洲、法国、澳大利亚、泰国、日本、韩国和孟加拉这些国家中分离出来。该病好发于人体的外露部位,多见于小腿和足部,农民、工人、赤脚工作者多见。CBM各个年龄阶段均可发病,好发于41~70岁的男性。硬壳小体是CBM的典型特征。CBM的诊断主要依靠临床表现、组织病理、真菌学检查和分子生物学方法。由于致病菌的多样性、抗真菌药物的生物有效性和临床表现的多样性,目前CBM的治疗方案尚无“金标准”,该病的治疗对临床医生来说是一大挑战。目的1.总结一例Fonsecaea nubica所致着色芽生菌病的临床和实验特征;2.回顾迄今国内外报道Fonsecaea nubica所致着色芽生菌病的文献。方法1.临床资料:我院临床诊断一例75岁男性Fonsecaea nubica致着色芽生病,发现右上背部红色斑块15月,曾有外伤史。2.组织病理学检查:于患者右上背皮损处环钻取材,福尔马林溶液固定标本,送检至病理科进行HE染色、PAS染色及六胺银染色,在显微镜下观察标本。3.真菌培养:刮取患者右上背部皮损,接种于沙堡罗葡萄糖琼脂培养基上在28℃下进行培养14天,看到菌落形成。4.直接真菌镜检(10%KOH):挑取菌落的菌丝,直接涂片,显微镜下观察标本。5.真菌荧光染色:接种标本于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上在28℃下进行小培养7天。小培养标本用伊文思蓝+钙荧光白染色后,荧光显微镜在白光、紫外线及混合光下观察。6.扫描电镜:用2.5%戊二醛溶液在4℃下固定标本4小时,用乙醇(50%、70%、90%和100%)进行脱水后,在扫描电镜下进行观察。7.分子生物学方法:提取菌落DNA,分别对其转录间隔区序列(ITS)和肌动蛋白(ACT1)进行PCR扩增,PCR产物送至擎科生物进行测序。8.体外药敏试验:根据美国临床和实验室标准化研究院推荐的CLSI 38-A2方案,选择近平滑念珠菌ATCC 22019作为质控菌株,检测下列抗真菌药物的MIC(最小抑菌浓度)值:伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素B和氟康唑。9.系统发育树:用MEG6.0软件基于ITS及邻近序列构建Fonsecaea nubica的系统发育树。10.回顾国内外已报道的F.nubica致着色芽生菌病,通过中国知网、万方数据库、PubMed、MEDLINE和Elsevier进行检索,对其病史、临床表现、组织病理表现、真菌直接镜检、真菌培养、扫描电镜、分子生物学、体外药敏试验和治疗方案进行统计分析。结果1临床资料:患者男,75岁,河南农民,因“右背部红色斑块15月”就诊于我院皮肤科。皮肤科检查:右背部可见一大小为40mm×10mm红色斑块,境界清楚,形状不规则,皮损高于皮肤表面,表面可见多个黑点,无鳞屑、化脓、破溃,无局部淋巴结肿大。结合临床表现、组织病理、真菌学检查和分子生物学检查诊断为Fonsecaea nubica致着色芽生菌病。治疗经过:给予口服伊曲康唑治疗16周联合手术治疗后痊愈,随访8个月未复发。2组织病理:HE染色:表皮可见假上皮瘤样增生,真皮内可见肉芽肿性改变,多核巨细胞内可见蔟状分布的硬壳小体。PAS染色及六胺银染色阳性。3真菌培养:可见生长缓慢的黑色菌落,中央微隆起,表面可见绒毛样菌丝。4真菌直接镜检:观察到棕色分隔菌丝。5真菌荧光染色:可见无数淡棕色、有隔膜的分生孢子和喙枝孢型的分生孢子。6扫描电镜:镜下可见喙枝孢型分生孢子,分生孢子呈椭圆形,其上存在齿状突起,多个分生孢子位于分生孢子梗顶端。7分子生物学:将所测得的菌株核苷酸序列通过BLAST,在GenBank数据库进行同源序列比较。PCR产物经鉴定与F.nubica菌株CBS 269.64同源性为100%(GenBank编号:MH988741)。8体外药敏试验:伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素B和氟康唑的MIC值分别为0.5μg/ml、0.5μg/ml、8μg/ml和32μg/ml,伊曲康唑和特比萘芬的MIC值均低于两性霉素B和氟康唑。9用MEG6.0软件基于ITS及邻近序列构建Fonsecaea nubica的系统发育树。10文献资料:经文献检索,共5例F.nubica致CBM纳入该文献研究。日本1例,法国1例,孟加拉1例,中国广东2例,患者均为男性,平均年龄52.6岁,最小年龄32岁,最大年龄66岁;平均病程5.1年,最短1年,最长10年;5例患者皮损分别位于右下肢、右大腿、右手腕、左上肢、右耳廓。5例均有外伤史。5例皮损主要为斑块型,其中1例伴左腕、左肘关节活动异常。5例均行组织病理检查,其中4例HE染色可见肉芽肿性炎症改变及硬壳小体。2例行直接真菌镜检,仅1例观察到硬壳小体。5例均行真菌培养,表现为黑色、灰色、橄榄色、天鹅绒样状的菌落。5例均行真菌小培养镜检,可见深棕色、棕色、淡棕色分隔菌丝,淡棕色分生孢子,呈顶生或者间生,为单细胞,短棒状,单链状或者短链状排列,部分可见齿状突起。5例均对病原菌rDNA的ITS序列进行测序,PCR产物经鉴定,最终确定菌种为F.nubica。2例进行了体外抗真菌药物敏感试验,1例的MIC值:棘白菌素类(卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净)>两性霉素B>伏立康唑>伊曲康唑和泊沙康唑。1例的MIC值:氟康唑>两性霉素B>特比萘芬=伊曲康唑。1例治疗方案未提及,余4例分别采取伊曲康唑、特比萘芬、特比萘芬联合伊曲康唑治疗,均好转。结论1.结合临床特征、组织病理、真菌学和分子生物学方法确诊一例Fonsecaea nubica所致着色芽生菌病。2.迄今国内外文献报道5例Fonsecaea nubica所致着色芽生菌病,本案例为第6例,系中国北方首例。