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猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）在我国猪群中普遍存在且流行不同亚型,经常发生基因重组而形成新型猪流感病毒。由于猪气管上皮同时含有类人α-2,6和类禽α-2,3受体,既可感染人流感病毒又可感染禽流感病毒,猪被认为是禽流感病毒适应人类的中间宿主,也是新型重组流感病毒产生的“混合器”。因此,SIV进化动态研究具有重要的公共卫生意义。相关流行病学调查表明,国内主要流行的欧亚类禽（Eurasian avian-like,EA）H1N1 SIV具有多种基因型,其中G4为目前的优势基因型;而G4相较于前期流行的G5基因型,在基因组成上的主要差异是2009大流行（Pandemic 09,Pdm09）H1N1来源的M基因取代了 EA-H1N1源的M基因。鉴于M基因编码的基质蛋白M1和离子通道蛋白M2在流感病毒生命周期的多个阶段起重要作用,Pdm09源M基因的引入极有可能对EA-H1N1病毒的体内外特性造成影响,有必要对其致病性及传播性等进行测定,评估跨物种感染能力并探讨相关机制。1.Pdm09源M基因对H1N1亚型猪流感病毒体外生物学特性的影响在G5基因型EA-H1N1猪流感病毒A/Swine/Jiangsu/01/2016（JS01）的8个反向遗传学质粒基础上,将Pdm09源H1N1猪流感病毒A/Swine/Jiangsu/48/2010（JS48）的M基因替换至JS01中,拯救获得两株模式病毒rJS01和rJS48M。经蚀斑纯化后,测定了 2株重组病毒的HA、TCID50、EID50等基本生物学特性,并比较了病毒感染细胞的Ml、M2蛋白表达水平和自噬水平;进一步通过透射电镜对病毒粒子形态进行了观察。结果显示,rJS01和rJS48M的基本生物学特性相当;两者以0.1MOI在MDCK和A549细胞上的复制能力均不具有显著差异;rJS01和rJS48M均能够诱导MDCK细胞发生自噬,但自噬水平差异不显著。但是,rJS48M在感染MDCK、A549细胞后6h和9h引起的M2蛋白表达水平显著高于rJS01。此外,电镜结果显示尽管rJS48M和rJS01子代病毒粒子形态均多为球状,但rJS48M中丝状病毒粒子的占比显著高于rJS01。因此表明,Pdm09源M基因能够促进M2蛋白表达并影响EA-H1N1病毒粒子形态。2.Pdm09源M基因对H1N1亚型猪流感病毒体内致病性与传播性的影响及其分子基础为了评价2株模式病毒的体内致病性与传播性,首先将rJS01和rJS48分别以106.0EID50滴鼻接种6周龄BALB/c小鼠,连续观察14d并记录小鼠的体重变化情况,同时对肺组织进行病理切片观察、病毒载量测定及IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子相对表达量的测定。接下来,通过下载GISAID数据库中2009～2020年A型H1N1流感病毒M基因序列对JS01和JS48病毒M基因不同功能区差异氨基酸的流行占比进行分析,并据此构建2株M基因嵌合的重组病毒rJ142和r41J2,进而评价了其对小鼠的致病性。然后,对所获的共4株重组病毒进行了豚鼠传播性的测定。小鼠实验结果表明,含有Pdm09源M基因的EA-H1N1病毒在小鼠体内具有更强的致病性与复制能力,rJS48M在小鼠肺组织中有显著更高的病毒载量,在肺组织上引起更强的病理变化以及炎性因子表达。豚鼠实验结果表明含有Pdm09源M基因的EA-H1N 1病毒具有了在豚鼠间的直接接触传播能力,在rJS01骨架上嵌合rJS48 M2蛋白C末端结构域的重组病毒rJ142另外还获得了气源性传播能力。3.从与宿主蛋白互作角度探讨Pdm09源M基因影响H1N1亚型猪流感病毒特性的分子机制为了从与宿主蛋白互作角度解析rJS48M相较于rJS01具有更强小鼠致病性与豚鼠传播性的分子机制,首先将JS01和JS48 M2蛋白分别以pCDNA3.1为载体构建带有Flag和HA双标签的真核表达质粒,并经间接免疫荧光鉴定M2蛋白成功表达。接下来,通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CoIP）结合液相色谱—串联质谱（LC-MS/MS）技术,筛选293T细胞中与M2蛋白存在相互作用的宿主蛋白,并进行Gene Ontology（GO）注释以及KEGG通路富集分析,进而对差异互作蛋白进行Western blot验证。结果表明,GO分析中与M2互作的宿主蛋白主要富集在核酸相关蛋白,其中与JS01-M2互作的宿主蛋白主要富集在细胞骨架相关蛋白和病毒过程,而JS48-M2则主要为细胞生命活动相关蛋白以及核酸复制调控相关蛋白;KEGG分析中与M2互作的宿主蛋白通路主要与细胞吞噬相关,其中与JS01-M2互作的差异蛋白通路主要与RNA转运相关,而JS48-M2则主要与DNA复制相关;从中选取的Tublin、MOY6和CAP2A2蛋白经Western blot验证后表明,三者均为M2互作蛋白,但JS01和JS48的M2蛋白在与MOY6和CAP2A2蛋白的互作水平上具有显著差异。