脓毒症是机体对感染的反应失调导致危及生命的器官功能障碍。尽管当今诊疗水平和高级生命支持技术飞速发展,脓毒症的发病率和死亡率仍很高。由于脓毒症的发病机制复杂,目前尚无特效治疗药物。因此,阐明脓毒症的发病机制和寻找潜在治疗药物对于促进人类健康具有重要意义。大量证据表明血管内皮屏障功能障碍是脓毒症多器官受损的病理生理基础。近年来,已有实验证实保护内皮屏障功能可大大降低不同模型的脓毒症小鼠病死率,提示针对内皮屏障功能破坏这一环节进行干预或许能为脓毒症治疗带来新的思路。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分,是脓毒症发生发展的重要致病因子。LPS的经典受体是Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4),后来的研究发现晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end products,RAGE)同样可与LPS结合,促进脓毒症发生发展。Sirtuins 是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖性的Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶。哺乳动物细胞的七种Sirtuins(SIRT1-SIRT7)显示出不同的亚细胞定位。SIRT3主要定位于线粒体中,调节多种线粒体功能,比如脂肪酸氧化、糖代谢、抗氧化反应和线粒体动力学变化等。研究表明,SIRT3具有血管屏障功能保护作用。在晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)刺激的内皮祖细胞中,RAGE受体激活可介导SIRT3蛋白表达下调。我们推测,RAGE受体可能也参与了 LPS介导的SIRT3信号改变。虎杖苷(polydatin,PD)是传统中药虎杖中提取的有效成分,具有具有抗炎、抗氧化、抗血栓、保护心肌等作用。此外,我们的既往研究还证实PD具有抗休克、改善微循环以及多器官功能保护作用。在脓毒症和失血性休克的动物模型中,我们发现了 PD通过上调SIRT3的去乙酰化酶活性和蛋白表达从而缓解小肠和肾脏损伤。因此,PD很有可能通过激活SIRT3发挥脓毒症内皮屏障功能保护作用。锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,SOD2)是线粒体的关键抗氧化酶。细胞内ROS水平增加与SOD2活性降低和乙酰化增加有关。ROS生成增加促进VE-cadherin和β-catenin的解离,从而导致内皮通透性增高。SIRT3对SOD2赖氨酸位点的去乙酰化增强了 SOD2活性,促进ROS的清除。由此可见,SIRT3很有可能通过去乙酰化SOD2,增强ROS的清除,抑制LPS导致的内皮屏障功能障碍。亲环蛋白D(Cyclophilin D,CypD)是调控线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的重要组成分子。抑制CypD可显著改善失血性休克造成的线粒体膜电位下降和血管通透性增加。我们的前期研究证实SIRT3介导的CypD去乙酰化抑制失血性休克时mPTP开放和线粒体损伤。我们猜测,SIRT3介导的CypD去乙酰化同样发挥内皮屏障功能保护作用。而PD能够通过增强SIRT3介导的SOD2和CypD去乙酰化,恢复线粒体稳态,抑制LPS造成的血管内皮屏障功能障碍。目的:本研究拟通过建立细胞和动物水平的脓毒症模型,探讨虎杖苷是否通过激活SIRT3发挥血管内皮屏障功能保护作用,并研究其具体机制。研究结果将为脓毒症的发病机制提供新思路,为脓毒症治疗提供潜在治疗药物和作用靶点。方法:在细胞水平,以原代人脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cells,pHUVECs)为研究对象,建立LPS刺激的脓毒症细胞模型。采用SIRT3活性检测试剂盒检测SIRT3活性、免疫印迹法检测SIRT3蛋白表达情况。运用SIRT3特异性抑制剂3-TYP探讨PD的内皮保护作用是否依赖于SIRT3的激活。采用F-actin染色观察内皮细胞骨架蛋白分布情况,采用免疫共沉淀技术检测黏附连接蛋白VE-cadherin与β-catenin复合物;采用跨内皮电阻仪及荧光标记的右旋糖酐漏过率法检测单层内皮细胞通透性。运用腺病毒过表达和siRNA干扰技术进一步验证SIRT3蛋白在内皮屏障保护中的作用。采用免疫沉淀检测SOD2乙酰化水平;采用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平;采用MDA检测试剂盒检测MDA水平;运用SOD2 siRNA及mito-TEMPO验证SIRT3-SOD2-ROS途径在PD介导屏障功能保护中的作用。采用JC-1及钙黄绿素(calcein-AM)分别检测线粒体膜电势及线粒体通透性转变孔开放情况。运用CypD siRNA说明SIRT3-CypD通路在PD介导屏障功能保护中的作用。运用RAGE中和抗体探讨RAGE在LPS介导的SIRT3信号改变中的作用。在动物水平,用LPS腹腔注射建立脓毒症小鼠的动物模型,采用Evans blue染料检测小鼠各脏器血管渗漏情况。结果:1.LPS对内皮细胞SIRT3活性及蛋白表达的影响1.1 LPS呈时间依赖性引起内皮细胞SIRT3活性下降用1μg/ml的LPS分别刺激原代内皮细胞0、3、6、12、24 h后,检测各样品SIRT3的活性。结果发现,LPS刺激原代内皮细胞3 h后即出现SIRT3活性的显著下降,12 h达最低值,并且这种效应在24 h仍有统计学差异(F=17.023,P=0.000)。1.2 LPS呈时间依赖性引起内皮细胞SIRT3蛋白表达降低用1μg/ml的LPS分别刺激原代内皮细胞0、3、6、12、24 h后,检测各组SIRT3蛋白表达水平。结果提示,LPS刺激12 h后,内皮细胞SIRT3蛋白表达水平出现显著降低,并持续下降至24h(F=3.952,P=0.035)。2.PD对LPS所致内皮屏障功能障碍的保护作用依赖于SIRT3的激活2.1 PD及3-TYP对SIRT3活性的影响用PD(50 μM)及3-TYP(50 μM)分别处理原代内皮细胞2 h,检测各组SIRT3活性。结果提示,PD明显上调SIRT3活性,而3-TYP显著抑制SIRT3活性(F=623.534,P=0.000)。2.2 3-TYP对SIRT1活性的影响用3-TYP(50 μM)处理原代内皮细胞2h,检测SIRT1活性。结果提示,与Control组相比,3-TYP对原代内皮细胞SIRT1活性无显著影响(F=4.506,P=0.101)。结果说明了 3-TYP对SIRT3的特异性抑制作用。2.3 PD缓解LPS造成的内皮细胞SIRT3蛋白表达下降实验分为5个组:Control组为空白对照组;LPS组用1 μg/ml的LPS刺激原代内皮细胞12 h;PD组用50μM的PD刺激原代内皮细胞2 h;PD+LPS组用50μM的PD预处理原代内皮细胞2 h后,予以1μg/ml的LPS刺激12 h;PD+LPS+3-TYP组为PD(50 μM)以及3-TYP(50μM)共同预处理原代内皮细胞2 h后,予以1 μg/ml的LPS刺激12 h。各组细胞分别处理后检测SIRT3蛋白表达水平。结果显示,LPS明显降低内皮细胞SIRT3蛋白表达,而PD有效抑制LPS的作用,但PD的这种保护作用被3-TYP抑制(F=8.891,P=0.002)。结果提示PD可能通过抑制SIRT3蛋白表达下降发挥内皮保护效应。2.4 PD通过激活SIRT3有效逆转LPS造成的内皮细胞F-actin应力纤维形成及cadherin-catenin 复合物解体结果发现,PD预处理显著抑制LPS造成的应力纤维形成,而3-TYP抵消了PD的保护作用。免疫共沉淀实验发现PD抑制LPS造成的VE-cadherin与β-catenin的解体,而3-TYP解除了 PD的保护作用。结果表明,PD对内皮骨架和细胞间连接的保护作用依赖于SIRT3的激活。2.5 PD通过激活SIRT3从而逆转LPS造成的内皮细胞通透性增高结果发现,PD可显著缓解LPS造成的内皮细胞TER降低(F=78.571,P=0.000)及FITC-dextran 漏过增加(F=16.549,P=0.000),抑制 SIRT3 可明显逆转PD的保护作用,提示PD对LPS所致内皮通透性增高的保护作用依赖于SIRT3的激活。2.6 PD激活SIRT3从而缓解LPS造成的脓毒症小鼠多脏器血管渗漏增加LPS组小鼠给予15 mg/kg的LPS腹腔注射,对照组注射等体积生理盐水。PD+LPS组予以尾静脉注射30 mg/kg的PD,2 h后给予LPS腹腔注射,PD+LPS+3-TYP 组予以尾静脉注射 30 mg/kg 的 PD 及 5 mg/kg 的 3-TYP,2 h后给予LPS腹腔注射。结果发现,LPS导致小鼠肺脏(F=5.233,P=0.010)、肾脏(F=4.636,P=0.016)、肝脏(F=16.726,P=0.000)及小肠(F=15.991,P=0.000)血管渗漏明显增加,PD预处理可显著缓解各脏器血管渗漏情况,而抑制SIRT3则抵消了 PD的血管屏障保护作用。在体实验说明,PD有效改善脓毒症小鼠多脏器血管屏障功能受损,并且这种保护作用依赖于SIRT3的激活。3.SIRT3在LPS致内皮屏障功能障碍中的保护作用3.1 SIRT3过表达腺病毒上调SIRT3蛋白表达水平运用Flag和GFP标签的SIRT3过表达腺病毒进行实验。结果显示,在Ad-GFP和Ad-SIRT3转染原代内皮细胞后均检测到绿色荧光。在蛋白水平,Ad-SIRT3可明显上调SIRT3蛋白的表达,而Control组及Ad-GFP组无明显变化,标签蛋白Flag仅在Ad-SIRT3组可检测到(F=10.516,P=0.011)。结果证明了 SIRT3过表达腺病毒可有效上调SIRT3蛋白表达水平。3.2过表达SIRT3抑制LPS引起的内皮细胞F-actin应力纤维形成及cadherin-catenin 复合物解体结果显示,LPS造成内皮细胞应力纤维形成明显增加,而过表达SIRT3有效缓解了 LPS造成的应力纤维形成。免疫共沉淀实验亦证实过表达SIRT3有效阻断LPS引起的VE-cadherin和β-catenin复合体解离。3.3过表达SIRT3缓解LPS造成的内皮细胞通透性增加过表达SIRT3明显缓解LPS诱导的单层内皮细胞TER降低(F=7.020,P=0.012)和右旋糖酐漏过增加(F=4.284,P=0.044)。结果提示SIRT3过表达可有效缓解LPS造成的内皮细胞通透性增加,进一步证实了 SIRT3的内皮屏障保护功能。3.4 SIRT3 siRNA下调内皮细胞SIRT3表达结果可见,SIRT3 siRNA明显下调原代内皮细胞SIRT3蛋白表达(t=6.020,P=0.004)。3.5敲除SIRT3加剧LPS造成的应力纤维形成和cadherin-catenin复合物解体敲除SIRT3明显加剧LPS引起的F-actin应力纤维形成及cadherin-catenin复合物解离。结果从反面说明了 SIRT3对内皮细胞屏障功能的保护作用。3.6敲除SIRT3加剧LPS造成的内皮细胞通透性增高敲除SIRT3加剧了 LPS造成的单层内皮细胞TER降低(F=15.043,P=0.001)及FITC标记的右旋糖酐渗漏增加(F=33.627,P=0.000),结果进一步说明了SIRT3对于内皮屏障的保护作用。4.PD通过SIRT3-SOD2-ROS途径保护内皮屏障功能4.1 PD激活SIRT3从而影响SOD2的乙酰化及活性水平LPS引起内皮细胞SOD2的乙酰化水平明显上升,PD预处理可抑制LPS的作用,而3-TYP又解除了 PD的保护作用。相应的,SOD2活性检测呈现出与乙酰化水平相反的趋势(F=55.429,P=0.000)。4.2 PD激活SIRT3从而降低LPS引起的ROS增加LPS诱导ROS大量产生,PD预处理明显缓解ROS增加,而3-TYP抵消了PD的作用(F=14.699,P=0.000)。结果说明,PD通过激活SIRT3从而降低LPS造成的ROS水平增加。4.3 PD激活SIRT3从而降低LPS引起的MDA水平增加PD明显抑制LPS诱导的MDA水平增加,而3-TYP解除了 PD的保护作用(F=7.963,P=0.004)。综上可知,PD通过激活SIRT3从而抑制LPS引起的内皮细胞ROS水平增加及MDA水平上升,提示PD很有可能通过SIRT3-SOD2-ROS途径发挥屏障功能保护作用。4.4 SOD2 siRNA抑制SOD2蛋白表达免疫印迹结果示,SOD2 siRNA可有效敲除SOD2在原代内皮细胞的表达(t=9.353,P=0.001)。4.5敲除SOD2抵消SIRT3过表达的屏障保护效应SOD2 siRNA显著抑制了 Ad-SIRT3引起的单层内皮细胞TER升高(F=7.467,P=0.010)及FITC-dextran 渗漏减少(F=6.620,P=0.015)。结果提示,SIRT3 介导的SOD2去乙酰化发挥内皮屏障保护作用。4.6清除线粒体ROS改善LPS引起的内皮细胞通透性增高mito-TEMPO可明显改善LPS引起的单层内皮细胞TER降低(F=9.701,P=0.005)和 FITC-dextran 渗漏增加(F=6.026,P=0.019),而给予 SIRT3 抑制剂3-TYP可消除mito-TEMPO的屏障保护效应。综上可知,SIRT3-SOD2-ROS途径抑制LPS造成的内皮屏障功能障碍。5.PD通过SIRT3-CypD通路改善LPS引起的内皮通透性增加5.1 PD激活SIRT3从而抑制LPS引起的CypD乙酰化增加LPS诱导CypD乙酰化水平升高,并且抑制SIRT3与CypD之间的直接相互作用,PD改善LPS导致的上述效应,而给予SIRT3抑制剂3-TYP后,PD的保护作用被解除。结果说明,PD增强SIRT3与CypD之间的直接相互作用,从而促进CypD去乙酰化。5.2 PD激活SIRT3从而抑制LPS导致的内皮细胞线粒体膜电位降低PD预处理明显抑制了 LPS导致的内皮细胞线粒体膜电位降低,而抑制SIRT3又逆转了 PD的作用。结果提示,PD通过激活SIRT3改善LPS造成的内皮细胞线粒体膜电位降低。5.3 PD激活SIRT3从而抑制LPS导致的内皮细胞线粒体通透性转变孔开放PD预处理抑制LPS造成的细胞内钙黄绿素荧光减弱,而3-TYP明显抑制PD的这种作用。结果提示,PD可通过激活SIRT3抑制LPS引起的线粒体通透性转变孔开放。5.4 CypD siRNA抑制内皮细胞CypD蛋白表达CypD siRNA有效干扰CypD在原代内皮细胞的表达(t=16.215,P=0.000)。5.5 敲除CypD缓解LPS造成的内皮细胞通透性增高CypD敲除可明显缓解LPS造成的TER降低(F=4.975,P=0.031)和FITC-dextran 渗漏增加(F=8.684,P=0.007)。结果提示,SIRT3 激活可增强 CypD去乙酰化,从而缓解LPS诱导的内皮通透性增高。6.RAGE受体参与LPS介导的SIRT3活性及蛋白改变6.1 RAGE参与了 LPS介导的SIRT3活性下降Control 为对照组,LPS 为 LPS(1μg/mL)刺激 12 h 组,RAGE antibody 为RAGE中和抗体(10 μg/mL)处理1h组,RAGE antibody+LPS为RAGE中和抗体(10μg/mL)预处理1 h后给予LPS(1μg/mL)刺激12 h组。结果显示,RAGE中和抗体可有效缓解LPS造成的SIRT3活性下降(F=6.497,P=0.015)。结果提示,RAGE受体参与了 LPS介导的SIRT3活性改变。6.2 RAGE参与了 LPS介导的SIRT3蛋白表达下降RAGE中和抗体阻滞了 LPS介导的SIRT3蛋白表达下降(F=4.113,P=0.049)。综上可知,RAGE参与了 LPS介导的SIRT3活性及蛋白表达水平的下调。结论:1.LPS可造成内皮细胞去乙酰化酶SIRT3活性及蛋白表达水平下调;2.PD能够通过激活SIRT3,从而抑制LPS导致的血管内皮屏障功能障碍;3.PD通过增强SIRT3对下游靶蛋白SOD2和CypD的去乙酰化修饰,促进线粒体功能正常运转,从而发挥内皮屏障功能保护作用;4.RAGE受体参与LPS导致的SIRT3活性及蛋白表达变化。