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质粒是是基因水平转移的重要载体。质粒经常含有宿主适应环境的表型基因,比如携带抗性基因,产生杀虫毒素、编码对环境污染物降解的基因等。对质粒进化的研究为我们了解这些重要表型基因的进化提供了一种重要途径。形成整合质粒是质粒进化的一种特殊表型,一个质粒直接与另一个质粒融合来获得其编码的潜在有益基因从而帮助宿主生存。据报道有很多质粒都含有两个或多个有功能的复制子,这暗示整合质粒普遍存在。然而如果一个天然整合质粒经历了复杂的重组过程,它可能不能分离成其组成质粒,那么它的精确的进化过程也就很难被解析。目前为止,只有个别整合质粒鉴定了其形成过程,同源重组和转座子介导的整合被证实参与了这些融合质粒的形成。一些研究推测oriT位点特异性重组可能参与质粒的进化,但缺少实验证据。对整合质粒的研究可能会帮助我们深入了解这一机制。本文研究的质粒pBMB0228是一个来自苏云金芽胞杆菌YBT-1518的内生质粒,前期的工作发现这个17.7kb的质粒上含有两个杀线虫晶体蛋白基因cry55Aal和cry6Aa2。pBMB0228是目前为止发现的第一个具有典型杀虫晶体蛋白基因的小质粒。序列分析发现这个质粒除了含有两个杀虫晶体蛋白基因之外,还含有两套复制区和两个接合转移模块。从结构特征上看,pBMB0228很像是两个质粒融合成的天然整合质粒。本研究主要对该质粒的双份遗传元件的功能及其特性进行系统研究,结果如下：1.对pBMB0228的两套复制区进行克隆和功能验证证实这两个复制区都可以在苏云金芽胞杆菌中独立行使复制功能。对其两个接合转移模块进行克隆和接合转移实验表明,在自主转移质粒pAW63::Tn5401的帮助下,这两个接合转移模块都具有诱动质粒转移的功能。2.质粒pBMB0228能自发分离成两个质粒。测序分析发现分离发生在pBMB0228的oriT1和oriT2位点的24bp的核心序列内部。质粒pBMB0228的分离不依赖接合转移的发生,但是可以被接合转移推动。基因敲除实验表明pBMB0228编码的两个mob基因参与了其分离过程。体外切割实验证实了纯化的Mob02281和Mob02282对含有oriT1或oriT2的超螺旋DNA都具有切割活性。重组系统实验证实了Mob02281或Mob02282能介导oriTl和oriT2之间的位点特异性重组。综合以上实验充分证实pBMB0228的分离机制是Mob蛋白介导的oriT位点特异性重组。3.分离的两个质粒还能融合。分离质粒pBMB02281和pBMB02282都分别含有一个mob基因和一个oriT位点,实验证实这两套接合转移元件能分别介导对应质粒的被动转移。当它们被接合转移到同一个细胞中,能再通过Mob蛋白介导的oriT位点分子间重组导致两个质粒融合成pBMB0228。以上结果将Mob蛋白的接合转移功能和位点特异性重组活性与整合质粒的形成建立了联系,于是,我们提出了一种的质粒通过松弛酶(pBMB0228上称为Mob蛋白)和oriT位点进化的模型。4.对介导pBMB0228分离的必需元件mob02281基因和oriT位点加以利用,构建了一个重组载体pRec-mob1-Ts。该载体具有接合转移的能力,可将携带的外源基因-cry6Aa转移到多个芽胞杆菌中,克服了一些难以转化的芽胞杆菌菌株的遗传操作的问题。利用该载体,在不引入抗性标记的情况下,成功的完成了Bt菌株BMB171中染色体上amyE基因的同框缺失,和两个杀虫晶体蛋白基因-cry5Ba2和cry2Aa9在amyE基因内的插入。5.完成了该质粒的出发菌株YBT-1518基因组的测序和拼接工作,并进行了初步分析。结果表明YBT-1518的基因组由1个环状染色体和6个环状质粒构成,其中染色体的长度为6,002,284个碱基对(bp)；质粒pBMB0228大小为17,706bp,质粒pBMB0229大小为45,206bp,质粒pBMB0230大小为49,195bp,质粒pBMB0231大小为146,276bp,质粒pBMB0232大小为171,593bp,质粒pBMB0233大小为240,661bp。本研究在实验室条件下重构了一个自然质粒的形成过程,将松弛酶的接合转移功能和位点特异性重组活性与质粒进化相联系,提出了一种质粒进化的模型。为质粒进化的研究提供了新的思路,增加了人们对质粒进化机制的认识。