【摘 要】
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第一部分GJB1两种突变在体外培养细胞中的表达与分布目的:探究两个GJB1基因突变（c.212T＞G和c.311A＞C）所产生的Cx32蛋白突变体在外周雪旺氏模式细胞RSC-96及原代少突胶质细胞中的分布与表达情况。方法:1.分别构建携带c.212T＞G和c.311A＞C的GJB1突变基因质粒EGFP-GJB1-I71S,EGFP-GJB1-K104T;构建携带c.212T＞G和c.311A＞C的
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第一部分GJB1两种突变在体外培养细胞中的表达与分布目的:探究两个GJB1基因突变（c.212T＞G和c.311A＞C）所产生的Cx32蛋白突变体在外周雪旺氏模式细胞RSC-96及原代少突胶质细胞中的分布与表达情况。方法:1.分别构建携带c.212T＞G和c.311A＞C的GJB1突变基因质粒EGFP-GJB1-I71S,EGFP-GJB1-K104T;构建携带c.212T＞G和c.311A＞C的慢病毒表达载体。2.将成功构建的质粒转染入RSC-96细胞培养至2天,病毒转染入少突胶质细胞培养至14天。3.分别提取两种细胞的蛋白,通过免疫印迹检测两种突变体Cx32的表达水平;同时使用免疫荧光技术检测两种突变体Cx32蛋白在两种细胞内的分布情况。结果:1.与对照组相比,Cx32I71S总蛋白及膜蛋白表达均降低（P＜0.001）,Cx32K104T膜蛋白表达降低（P＜0.001）,而总蛋白变化无统计学差异（P＞0.05）,该表达趋势在两种细胞中一致。2.与对照组相比,Cx32I71S与Cx32K104T均异常分布于内质网。（在RSC-96细胞和少突胶质细胞中,两种突变体均会导致Cx32在内质网中沉积）。结论:两种蛋白突变体在内质网中分布显著增多,两种GJB1突变体均会影响膜蛋白表达及定位,可能与CMTX1致病机理相关。第二部分两GJB1突变通过激活内质网应激增加细胞凋亡目的:进一步明确GJB1两种突变体异常聚集于内质网是否会通过诱导内质网应激,从而导致凋亡发生。方法:1.将携带两种突变的质粒及病毒分别转染RSC-96细胞和少突胶质细胞后并优化培养条件至细胞成熟。2.通过免疫印迹检测内质网应激标志物Grp78在两种细胞中的表达情况,免疫荧光检测Cx32是否与内质网标志物Calreticulin共定位。3.通过免疫共沉淀（Co-IP）检测基础状态下及加入蛋白酶体抑制剂MG-132、溶酶体抑制剂CQ后泛素化蛋白ubiquitination的表达。4.流式细胞术检测基础状态下及加入内质网应激抑制剂4-PBA后细胞凋亡情况。结果:1.两种突变体均与内质网蛋白Calreticulin共定位;两种突变均会导致Grp78升高,且Cx32K104T较Cx32I71S升高更明显（P＜0.001）;给予内质网应激抑制剂4-PBA后两组间Grp78表达无统计学差异（P＞0.05）。2.蛋白酶体抑制剂MG-132,Cx32K104T组总蛋白恢复至与对照组无异,对Cx32I71S组无影响（P＞0.05）;溶酶体抑制剂CQ对两种突变蛋白表达无影响。3.与对照组相比,Cx32K104T组蛋白泛素化蛋白ubiquitination表达下降（P＜0.001）,而Cx32I71S组较对照组无差异。4.两种突变均导致细胞凋亡增加,且Cx32K104T较Cx32I71S增加更明显;使用4-PBA后,两种突变的凋亡均被抑制（P＜0.001）。结论:两种突变体均会激活内质网应激,且增加细胞凋亡,但Cx32K104T较Cx32I71S明显,可能是因为Cx32K104T影响泛素化降解所致。第三部分两种突变对少突胶质细胞膜电位及内向整流钾电流（KIR）的影响目的:研究两种突变对少突胶质细胞膜电位及Kir的影响。方法:1.将携带两种突变的病毒转染至少突胶质细胞培养至14天;2.使用全细胞膜片钳技术,记录少突胶质细胞的膜电位Kir。结果:与对照组相比,两种突变均会导致少突胶质细胞的膜电位和Kir降低,且Cx32K104T较Cx32I71S降低更明显（P＜0.001）。结论:Cx32K104T对少突胶质细胞电生理影响更显著,提示这种影响可能是Cx32K104T突变导致中枢神经系统（CNS）症状的机制。
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