论文部分内容阅读
目的1、构建针对SMYD3(SET and MYND domaineontaining protein3)基因的microRNA真核表达载体,并转染乳腺癌MCF-7细胞检测沉默效果;2、研究沉默SMYD3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响;3、研究沉默SMYD3基因对乳腺癌MCF-7细胞WNT10B、c-Myc基因表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法:1、构建靶向SMYD3的4个microRNA真核表达载体和1个阴性对照载体,稳定转染MCF-7细胞;绿色荧光显微镜及流式细胞仪检测各组细胞绿色荧光蛋白表达率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SMYD3 mRNA表达变化,Westeron blot检测SMYD3蛋白抑制效果。2、二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法描绘细胞生长曲线,平板集落形成实验检测细胞转染前后增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Matrigel侵袭实验检测细胞体外侵袭能力;3、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SMYD3、WNT10B及c-Myc mRNA表达变化。结果:1、经测序证明所构建干扰序列正确插入pcDNA6.2-GW/ EmGFPmiR真核表达载体,序列完整。从4个干扰组筛选出mRNA及蛋白表达抑制效果均较好的pcDNA-SMYD3mi-3、pcDNA-SMYD3mi-4作进一步研究。2、MTT结果显示两干扰组细胞生长速度相对明显减慢(P﹤0.05);两干扰组集落形成率分别为(16.5%)、(18.7%),与空白组(79.4%)相比显著减少(P<0.05),阴性对照组(76.6%)和空白组相比无显著差异(P>0.05);两干扰组早期凋亡率明显增加,分别为(19.3±1.61)%、(17.6±0.45)%,相对阴性对照组(2.1±0.35)%和空白对照组(0.97±0.49)%有显著性差异(P<0.05);Matrigel侵袭实验结果显示两干扰组穿膜细胞数分别为(7.53±2.00)(9.13±2.50),与空白组(63.40±6.85)和阴性对照组(66.69±4.63)相比显著减少(P<0.05),差异有统计学意义; 3、两干扰组mRNA相对表达量分别为: WNT10B ( 0.012±0.001 )、( 0.013±0.001 ) , c-Myc(0.054±0.005)、(0.055±0.002),与阴性及空白对照组相比均明显下调(P﹤0.05)。结论:1、所构建的microRNA真核表达载体能够显著抑制乳腺癌MCF-7细胞SMYD3的mRNA及蛋白的表达,表明构建载体可用于进一步基因功能的研究。2.沉默SMYD3基因可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,促进细胞的凋亡,抑制细胞的侵袭。3、在乳腺癌中,SMYD3可能通过激活Wnt/β-catenin通路上调WNT10B及c-Myc,实现对细胞增殖、侵袭的促进,同时抑制细胞的凋亡,通过引起细胞上皮间质化引起细胞转移。