论文部分内容阅读
双夹心ELISA是一种能够灵敏地检测待测样本中抗原含量的有效方法。建立高灵敏的双夹心ELISA需要一对识别不同抗原表位的特异性抗体。传统的单克隆抗体制备方法是通过全长蛋白免疫小鼠,进而通过全长蛋白进行筛选得到针对目标抗原的单克隆抗体。但是通过这种传统方法获得用于建立夹心ELISA的配对抗体有一定的难度,因为通过这种方法得到的抗体需要进行大量的后续筛选才有可能获得满意的用于建立夹心ELISA的配对抗体;其次就是所获得的抗体所针对的抗原表位不明确,抗原表位鉴定工作也需要花费一定的时间。针对以上问题,我们以胃泌素释放肽前体(proGRP)双夹心ELISA方法的建立为例,设计了一种新型基于表位肽的免疫策略来获得可用于双夹心ELISA配对的单克隆抗体。首先利用生物信息学软件对proGRP全长蛋白进行分析,分析其三维结构,亲水性,可接触性以及糖基化位点。选择空间结构上互不干扰的连续氨基酸序列作为proGRP双夹心ELISA抗体的抗原表位,理论上针对这些表位的抗体可以满足用于建立夹心ELISA的配对抗体。但是由于表位小肽属于半抗原,只有免疫反应性而无免疫原性,不能有效的引起机体的免疫应答。据以往研究表明,利用病毒样颗粒(VLPs)以及腺病毒载体作为载体来呈递表位肽不仅能够增加表位肽的拷贝数并且能够有效地增强其的免疫原性。因此我们选择了乙肝病毒核心蛋白(HBc)和5型腺病毒(Ad5)作为载体来呈递proGRP表位小肽,并且采用交叉免疫策略来进一步增强免疫效果。为了增加获得特异性单克隆抗体的几率,在抗体筛选过程中,我们采用交叉筛选的策略,即筛选抗原用融合小肽的颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)E 片段(PGRN-E)蛋白。为了验证本课题中基于表位小肽免疫策略的可行性,并获得可用于建立夹心ELISA的配对抗体,本课题将从以下三个方面展开研究。1.proGRP线性抗原表位预测以及免疫原制备1)proGRP抗原表位预测:首先通过ExPASY软件、COBEpro数据库和Bepipred数据库对proGRP的线性抗原表位进行预测。我们选择了三个表位肽作为制备建立proGRP双夹心ELISA所需配对抗体的抗原表位,它们分别为Epitopel(EP1):KSTGESSSVSER(30-41aa),Epitope2(EP2):ENRNHQPPQPKA(69-80aa)和 Epitope3(EP3):NQQPSWDSEDSS(83-94aa)。2)E1区表达分泌型HBc-proGRP小肽融合蛋白与Hexon区经proGRP表位小肽修饰的腺病毒载体构建及病毒颗粒的包装纯化:首先通过分子克隆手段,将proGRP 小 肽 基 因 插 入 的 腺 病 毒 骨 架 载 体pAd5-Hexon-HRV5-BamH 1-LacZ-Sfu1/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP 的 Hexon的HVR5区,从而获得Hexon区经proGRP表位小肽修饰的腺病毒载体pAd5-Hexon-proGRP EPl-3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,同时将 proGRP 表位小肽连入本实验室保存的腺病毒 E1 区穿梭载体pAd5-E1/H1H2-HBc-MCS-Flag,获得表达分泌型HBc-proGRP小肽融合蛋白的 pAd5-E1/H1 H2-HBc-proGRP EP1-3-Flag 表达载体。将 Sca 线性化的pAd5-E1/H1H2-HBc-proGRP EP1-3-Flag 穿梭载体与Cla1 线性化的pAd5-Hexon-proGRP EP1-3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP 骨架载体共转化至E coli BJ5183中,通过同源重组,获得E1区表达分泌型HBc-proGRP小肽融合蛋白与Hexon区经proGRP表位小肽修饰的腺病毒载体p Ad5-E 1/H1 H2-HBc-proGRP EP1-3/Hexon-proGRP EP1-3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP。将上述构建的三种腺病毒载体经PacI线性化后转染HEK293细胞,经包装后扩增,最后采用CsCl密度梯度离心法纯化获得相应的腺病毒颗粒。3)表达融合HBc-proGRP小肽蛋白的原核表达载体构建及融合蛋白表达与纯化:将三种不同的proGRP表位肽基因酶切连入本实验室构建的pET-28a/HBc-MCS-His原核表达载体中,由此获得表达融合HBc-proGRP小肽蛋白的原核表达载体pET-28a/HBc-proGRPEP1-3-His。将所获得的原核表达载体电转BL21(DE3)感受态细胞,然后进行目的蛋白的表达与纯化,并通过SDS-PAGE及Western blot检测所纯化的目的蛋白。2.针对proGRP表位肽单克隆抗体的制备1)表达融合PGRN-E-proGRP小肽蛋白的原核表达载体构建及融合蛋白表达与纯化:将三种不同的proGRP小肽分别连入本实验室构建的pRSET-B/PGRN-E-MCS-His原核表达载体中,由此获得表达相应融合蛋白的原核表达载体pRSET-B/PGRN-E-proGRP EP1-3-His。将获得的上述原核表达载体电转BL21(DE3)感受态细胞,然后进行目的蛋白的表达与纯化,并通过SDS-PAGE及Western blot检测所纯化的目的蛋白。2)针对不同proGRP表位肽的单克隆抗体制备及其鉴定:通过常规的单克隆抗体制备流程,制备获得7株针对proGRP不同表位肽的单克隆抗体,其中针对proGRP EP1有2株,命名为anti-proGRP-EP-1、anti-proGRP-EP1-2;针对 proGRP EP2 有 4 株,命名为 anti-proGRP-EP2-1、anti-proGRP-EP2-2、anti-proGRP-EP2-3 及 anti-proGRP-EP2-4;针对 proGRP EP3 有 1 株,命名为anti-proGRP-EP3-1。最后通过Western blot对所获得的单克隆抗体的特异性进行检测,通过免疫荧光染色以及免疫共沉淀对抗体能否识别proGRP空间构象进行检测,结果表明7株抗体均能特异性识别proGRP的线性结构,除了EP2-1以外的6株抗体均能识别proGRP的空间结构。3.用于检测proGRP的双夹心ELISA方法的建立及应用1)真核及原核全长proGRP蛋白表达载体的构建及蛋白表达与纯化:通过PCR获得proGRP全长基因,然后将其分别连入商业化真核表达载体pCDNA3.1以及原核表达载体pET-28a,所获得的表达载体分别命名为pCDNA3.1/kozac-SP-proGRP-His 及 pET-28a/proGRP-His。将pCDNA3.1/kozac-SP-proGRP-His 转染 HEK293 细胞,72 小时后收上清,通过Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kit 试剂盒对 proGRP 真核蛋白进行纯化。将pET-28a/proGRP-His电转BL21(DE3)感受态细胞,然后进行目的蛋白的表达与纯化,并通过SDS-PAGE及Western blot检测所纯化的目的蛋白,结果表明,成功获得proGRP的真核与原核蛋白。2)用于检测proGRP双夹心ELISA方法的建立及其应用:用所得到的针对proGRP三个抗原表位的单克隆抗体进行捕获抗体和检测抗体的夹心配对,通过底物显色强度,筛选获得最佳的抗体配对组合,然后通过夹心ELISA进一步对捕获抗体、检测抗体以及亲和素的浓度进行了优化,由此建立了可以用于检测proGRP的双夹心ELISA。将所建立的双夹心ELISA方法检测小细胞肺癌患者血清以及小细胞肺癌细胞系上清,结果显示,本研究所建立的双夹心ELISA能够敏感检测到不同来源的待测样本中的proGRP的含量。综上所述,本课题取得了以下研究结果:1)运用生物信息学软件预测得到3个可以作为制备双夹心ELISA配对抗体所需的线性表位;2)采用基于表位肽的免疫策略成功制备获得特异性针对3个proGRP表位肽的7株单克隆抗体:3)通过ELISA成功获得用于建立检测proGRP双夹心ELISA的最佳配对抗体;4)所建立的proGRP双夹心ELISA能够敏感检测不同待测样品中proGRP蛋白水平。本课题的研究结果证实,所采用的基于表位肽的免疫策略的可行性。所采用的基于小肽的新型免疫策略为其它小肽表位的单克隆抗体的制备奠定了基础,在肿瘤免疫治疗(针对免疫检查点分子的中和抗体制备)及其它肿瘤标志物夹心ELISA制备方面有着重要的应用前景。